Продукты пищевые. Определение D-биотина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
ГОСТ EN 15607-2015
Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания D-биотина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Метод прошел валидацию при межлабораторных сравнительных испытаниях с использованием как обогащенных проб, так и проб с естественным содержанием D-биотина, а именно концентратов типа сухого завтрака - мюсли, сухого молока для грудных детей, лиофилизированных зеленых овощей с ветчиной, лиофилизированного куриного бульона и обогащенного апельсинового сока в диапазоне значений содержания D-биотина от 16 до 200 мкг/100 г.
Метод основан на выделении D-биотина из проб пищевых продуктов обработкой ферментами и количественном определении методом ВЭЖХ с послеколоночной дериватизацией.
Комплексообразование D-биотина с белком авидином является весьма специфическим. Поэтому авидин, ковалентно связанный с флуоресцентной меткой - флуоресцеин-5- изотиоцианитом, используется в качестве реагента для послеколоночной дериватизации D-биотина.
Термостат, поддерживающий температуру на уровне (37±2)°С.
Система для ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для ввода проб, флуориметрического детектора, позволяющего проводить измерения при длине волны возбуждения 490 нм и длине волны регистрации 520 нм, и системы для сбора и обработки данных, например интегратора.
Обращенно-фазовые аналитические колонки, например LiChrosper 100 RP-18 endcapped.
Приведенные ниже характеристики аналитической колонки обеспечивают разделение пиков аналитов до базовой линии:
a) длина колонки 250 мм;
b) внутренний диаметр 4,0 мм;
c) размер частиц 5 мкм.
Допускается использовать колонки иных размеров и с иным размером частиц. При этом параметры разделения на таких колонках должны быть проверены, с тем чтобы гарантировать получение сопоставимых результатов. Критерием эффективности подходящих аналитических колонок является разделение пиков аналитов до базовой линии.
Устройства для фильтрования подвижной фазы большого и малого размера, снабженные, например, фильтрами с размером пор 0,45 мкм.
Послеколоночный реактор, состоящий из системы для ввода реагента, например Т-образного смесителя со следующим за ним капиллярным реактором длиной 10 м, выполненным из политетрафторэтиленовой трубки внутреннего диаметра 0,5 мм, смотанной по спирали диаметром 14 мм. Капиллярные реакторы могут быть приобретены у компаний Супелко или MicroSolv Tech.
Метанол для ВЭЖХ, массовая доля основного вещества w(CH3OH) не менее 99,8%.
Раствор серной кислоты молярной концентрации c(H2SO4)=1 моль/дм3.
Раствор серной кислоты молярной концентрации c(H2SO4)=1,5 моль/дм3.
Лимонная кислота моногидрат, массовая доля основного вещества w(C6H8O7·H2O) не менее 99,7%.
Гидрофосфат натрия 2-водный, массовая доля основного вещества w(Na2HPO4·2H2O) не менее 99,8%.
Глутатион, массовая доля основного вещества w(C10H17N3O6S) не менее 98%.
Этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) 2-водный, массовая доля основного вещества w(C10H14N2Na2O
·2H2O) не менее 99%.
Гидрофосфат калия, массовая доля основного вещества w(K2HPO
) не менее 96%.
Дигидрофосфат калия, массовая доля основного вещества w(K2HPO) не менее 99,5%.
Подвижная фаза для ВЭЖХ. 80 объемных частей фосфатного буферного раствора с рН 6,0 смешивают с 20 объемными частями метанола и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм.
Така-диастаза, выделенная из Aspergillus Oryzae, удельная каталитическая активность 1500 нкат/мг (соответствует 100 МЕ/мг), для проб с высоким содержанием крахмала.
D-Биотин, массовая доля основного вещества w(C10H16N2O3S) не менее 99%.
D-Биоцитин, массовая доля основного вещества w(C16H28N4O4S) не менее 98%.
