Продукты пищевые. Определение ниацина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
ГОСТ EN 15652-2015
Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания ниацина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) после гидролиза пробы, который может быть проведен тремя способами: кислотный гидролиз (А), ферментативный гидролиз (В) и последовательный кислотный и щелочной гидролиз (С).
Метод был валидирован при межлабораторных сравнительных испытаниях на обогащенных и не обогащенных пищевых продуктах, а именно пробах концентратов типа сухого завтрака - мюсли и мюсли с шоколадом, вареном окороке, зеленом горошке, лиофилизированном зеленом горошке с ветчиной, лиофилизированном супе, обогащенном апельсиновом соке, сухом молоке и пшеничной муке в диапазоне значений содержания ниацина от 0,5 до 24мг/100 г.
Способы А и В приводят к аналогичным результатам для ниацина. В этих случаях ниацин определяется как суммарное содержание никотинамида и никотиновой кислоты в пересчете на никотиновую кислоту.
Способ С приводит к более высоким значениям содержания ниацина в необогащенных злаках по сравнению со способами А и В, но в остальных пищевых продуктах дает сходные результаты. В способе С никотинамид превращается в никотиновую кислоту, и ниацин определяется в форме никотиновой кислоты.
Витамеры ниацина извлекают из пищевых продуктов путем кислотного гидролиза (способ А), ферментативного гидролиза (способ В) или последовательного кислотного и щелочного гидролиза (способ С) и определяют методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием в режиме послеколоночной дериватизации под действием ультрафиолетового излучения. В способах А и В ниацин определяется как сумма содержаний никотинамида и никотиновой кислоты в пересчете на никотиновую кислоту после введение поправки на молекулярную массу. При щелочном гидролизе никотинамид полностью переходит в никотиновую кислоту.
Способ А является более производительным и экономичным, нежели способы В и С.
Способ В применяется, если требуется раздельное количественное определение никотинамида и никотиновой кислоты. Способ А для этих целей непригоден, поскольку при кислотном гидролизе никотинамид в небольшой степени превращается в никотиновую кислоту.
В способе С определяют общее содержание ниацина. Щелочной гидролиз может вызвать высвобождение никотиновой кислоты из других производных, как правило, не являющихся биологически активными, что приводит к завышенным значениям содержания ниацина в таких пищевых продуктах, как кукуруза или злаки.
Спектрофотометр, обеспечивающий измерения оптической плотности в диапазоне выбранных длин волн.
Термостат, поддерживающий температуру на уровне 37°С.
Автоклав, предназначенный для поддержания температуры на уровне 120°С.
Система для ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для ввода проб, флуориметрического детектора, позволяющего проводить измерения при длине волны возбуждения 322 нм и длине волны регистрации 380 нм, и системы для сбора и обработки данных, например интегратора.
Обращенно-фазовые аналитические колонки, например LiChrosper 60 RP-18 Select В endcapped. Могут быть использованы аналогичные продукты, если доказано, что их применение приводит к идентичным результатам. Приведенные ниже характеристики аналитической колонки обеспечивают разделение пиков аналитов до базовой линии:
a) длина колонки 250 мм;
b) внутренний диаметр 4,0 мм;
c) размер частиц 5 мкм.
Допускается использовать колонки иных размеров и с иным размером частиц.
Мембранный фильтр с размером пор, например 0,45 мкм.
Послеколоночный реактор и лампа ультрафиолетового света. Послеколоночный реактор состоит из политетрафторэтиленовой трубки (длина 5 м, внутренний диаметр 0,5 мм, внешний диаметр 1,6 мм), намотанной вокруг лампы ультрафиолетового света низкого давления (VL-120 BLB, 20 Вт, 365 нм, интенсивность излучения 55 мкВт/см2, изготовитель Vilber Lourmat.
Ацетат натрия, массовая доля основного вещества w(C2H3NaO2) не менее 99%.
Гидрофосфат калия, массовая доля основного вещества w(K2HPO4) не менее 99,5%.
Дигидрофосфат калия, массовая доля основного вещества w(KH2PO4) не менее 99,5%.
Раствор пероксида водорода, нестабилизированный, массовая доля пероксида водорода w(H2O2)=30%.
Сульфат меди, массовая доля основного вещества w(CuSO4·5H2O) не менее 99%.
Уксусная кислота, массовая доля основного вещества w(CH3COOH) не менее 99,8%.
Концентрированная соляная кислота (для способов А и С), w(НСl)=37,0%.
НАД+-гликогидролаза из Neurospora crassa (для способа В), активность 0,55 МЕ/мг белка.
Раствор уксусной кислоты, молярная концентрация с(СН3СООН)=5 моль/дм3.
Раствор ацетата натрия, молярная концентрация c(C2H3NaO2)=2,5 моль/дм3.
Раствор сульфата меди, молярная концентрация c(Cu(ll)SO4·5H2O)=0,005 моль/дм3.
Никотиновая кислота, массовая доля основного вещества w(C6H5NO2) не менее 99,5%
Никотинамид (для способов А и В) массовая доля основного вещества, w(C6H5NO2) не менее 99,5%
