Продукты пищевые. Определение содержания витамина Е (альфа-, бетта-, гамма- и дельта-токоферолов) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
ГОСТ EN 12822-2014
Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина Е в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Определение содержания витамина Е осуществляется путем определения α-, β-, γ- и δ-токоферолов. Активность витамина Е может быть рассчитана исходя из содержания токоферолов путем применения соответствующих коэффициентов.
Метод основан на определении α-, β-, γ- и δ-токоферолов в растворе пробы высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с фотометрическим (в ультрафиолетовой области) или, предпочтительнее, флуориметрическим детектированием. Для приготовления раствора пробы в большинстве случаев необходимо омыление материала пробы с последующей экстракцией аналитов. Определяемые соединения идентифицируют по значениям времени удерживания и количественно определяют при помощи внешнего стандарта по результатам измерений значений площадей или высот пиков. Допускается использование метода внутреннего стандарта, если соответствующие тесты по полноте обнаружения подтверждают, что поведение внутреннего стандарта и аналитов в процессе анализа тождественно.
Спектрофотометр для ультрафиолетовой области, пригодный для измерений оптической плотности при заданных длинах волн, снабженный кварцевыми кюветами, например с толщиной слоя 1 см.
Ротационный испаритель, в комплекте с водяной баней и устройством для создания вакуума.
Система для ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для инжектирования проб, флуориметрического детектора (длина волны возбуждения 295 нм, длина волны регистрации 330 нм) и интегратора или системы обработки данных.
Допускается использование спектрофотометрического детектора, пригодного для проведения измерений при длине волны 292 нм. В этом случае градуировочные растворы и растворы проб должны быть более концентрированными. При использовании спектрофотометрического детектора вероятность помех со стороны матрицы пробы увеличивается.
Для проведения испытаний пригодны нормально-фазовые аналитические колонки, например внутреннего диаметра от 4,0 до 4,6 мм, длиной от 100 до 250 мм, заполненные силикагелем с размером частиц 5 мкм.
Допускается использование колонок других типоразмеров с другим размером частиц. При необходимости для достижения требуемой степени разделения пиков проводят корректировку условий хроматографического разделения.
Критерием применимости аналитических колонок является разделение определяемых аналитов до базовой линии.
Примерами подходящих сорбентов, доступных для приобретения, являются LiChrosorb® Si 60, Spherisorb® Si, Hypersil® Si и Lichrospher® 100 DIOL.
Могут также применяться аналитические колонки с обращенной фазой, например С18, с размером частиц 5 мкм, внутренним диаметром от 4,0 до 4,6 мм, длиной от 100 до 250 мм. Примерами подходящих обращенно-фазовых сорбентов являются Spherisorb® ODS и Hypersil ® ODS. Большинство обращенно-фазовых сорбентов не разделяют β- и γ-токоферолы. Эти колонки, однако, могут использоваться для разделения α- и δ-токоферолов.
Устройство для фильтрования, пригодное для установки фильтров большого и малого размеров для фильтрования подвижной фазы и растворов проб, например с диаметром пор 0,45 мкм.
Фильтр для разделения фаз (применяется по выбору пользователя стандарта).
Метанол.
Этанол абсолютный, объемная доля 100%.
Этанол, объемная доля 96%.
Сульфат натрия, безводный.
Растворы гидроксида калия для омыления - водный раствор массовой концентрации 50 г/100 см3 или 60 г/100 см3 или водно-этанольный раствор 28 г/100 см3 при объемном соотношении этанола и воды 9:1.
Антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота (АК), аскорбат натрия, пирогаллол, сульфид натрия (Na2S) или бутилокситолуол (ВНТ).
Растворители и экстрагенты, например диэтиловый эфир (не содержащий перекисей), дихлорметан, петролейный эфир (выкипающий от 40°С до 60°С), н-гексан, этилацетат или подходящая их смесь.
Подвижные фазы для ВЭЖХ.
Примерами подходящих смесей (состав в объемных долях) являются: 3% 1,4-диоксана или 0,5% пропанола-2, или 3% трет-бутилметилового эфира в н-гексане или н-гептане для нормально-фазовой хроматографии (НФ) или от 1% до 10% воды в метаноле для обращенно-фазовой хроматографии (ОФ).
Образцы сравнения. β-, γ- и δ-токоферолы поставляет фирма Merck, α-токоферол доступен от различных поставщиков. Массовая доля основного вещества в образцах сравнения токоферолов может колебаться от 90% до 100%, поэтому необходимо определить массовую концентрацию градуировочного раствора спектрофотометрическим методом.
