Продукты пищевые. Определение содержания холекальциферола (витамина D3) и эргокальциферола (витамина D2) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
ГОСТ EN 12821-2014
Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина D3 (холекальциферол) или D2 (эргокальциферол) в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Витамин D3 присутствует, главным образом, в продуктах питания животного происхождения, в то время как витамин D2 - в дикорастущих грибах. Как витамин D3, так и витамин D2 могут присутствовать в витаминизированных пищевых продуктах. Настоящий стандарт не применим к пробам, содержащим одновременно как витамин D3, так и витамин D2.
Кроме исходных форм - витамина D3 и витамина D2, соответствующие метаболиты - 25-гидроксивитамин D и 1,25-дигидроксивитамин D, также обладают D-витаминной активностью. Настоящий стандарт распространяется на определение витамина D2 или витамина D3 по отдельности.
Метод основан на выделении витаминов D3 и D2 из пробы путем ее омыления и экстракции витаминов подходящим растворителем с последующей очисткой экстракта с помощью полупрепаративной нормально-фазовой высокоэффективной хроматографии (далее - ВЭЖХ) и количественным определением витаминов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
При определении витамина D3 в качестве внутреннего стандарта используют витамин D2. Если определению подлежит витамин D2, то в качестве внутреннего стандарта используют витамин D3.
Витамин D детектируют спектрофотометрическим методом в ультрафиолетовой области и идентифицируют пики по значениям времени удерживания и дополнительно по спектру поглощения в ультрафиолетовой области, если используется диодноматричный детектор. Количественный анализ проводят с применением внутреннего стандарта по результатам измерений значений высот или площадей пиков.
Спектрофотометр, пригодный для измерений оптической плотности при длине волны 265 нм.
Ротационный испаритель, в комплекте с водяной баней и устройством для создания вакуума.
Система для полупрепаративной ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для ввода проб, УФ-детектора, устройства для сбора заданной фракции элюента и самописца или интегратора.
Система для аналитической ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для ввода проб, УФ-детектора, самописца или интегратора, либо аналогичной системы для сбора данных.
Колонки для ВЭЖХ
- Колонка полупрепаративная длиной от 250 до 300 мм, внутренним диаметром от 4,0 до 8,0 мм, заполненная сорбентом для нормально-фазовой хроматографии, например силикагелем или силикагелем с привитыми циано- и аминогруппами с размером частиц 5 мкм.
- Колонка аналитическая длиной 250 мм, диаметром от 4,0 до 4,6 мм, заполненная обра- щенно-фазовым сорбентом, например с привитыми октадецильными (С18) группами, размером частиц 5 мкм.
Колонки других размеров, заполненных сорбентом с иным размером частиц, могут также быть использованы в соответствии с настоящим стандартом, если установлено, что они обеспечивают удовлетворительное отделение витамина D от мешающих компонентов матрицы.
Устройство для фильтрования, пригодное для установки фильтров как большого, так и малого размера для фильтрования подвижной фазы и растворов проб, например с диаметром пор 0,45 мкм.
Метанол.
Этанол абсолютный, объемная доля φ(C2H5OH) =100%.
Этанол, φ(C2H5OH)=96%.
Сульфат натрия, безводный.
Растворы гидроксида калия для омыления - водный раствор массовой концентрации ρ(КОН)=50 г/100 см3 или 60 г/100 см3 или водно-этанольный раствор ρ(КОН)=28 г/100 см3 при объемном соотношении этанола и воды 9:1.
Антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота (АК), аскорбат натрия, пирогаллол, сульфид натрия (Na2S) или бутилокситолуол (ВНТ).
Растворители и экстрагенты, например диэтиловый эфир (не содержащий перекисей), дихлорметан, петролейный эфир, н-гексан, этилацетат или подходящая их смесь.
Подвижные фазы для ВЭЖХ
Варианты подвижных фаз, пригодных для нормально-фазовой полупрепаративной ВЭЖХ:
- смесь н-гексана и пропанола-2 (98+2), (99+1) или (95+5);
- смесь н-гексана и изоамилового спирта (99+1);
- смесь н-гексана, пропанола-2 и тетрагидрофурана (98+1+1);
- смесь изооктана и изобутанола (99+1);
- смесь н-гептана и пропанола-2 (97+3).
Варианты подвижных фаз, пригодных для обращенно-фазовой аналитической ВЭЖХ:
- - метанол;
- - смеси метанола и воды (95+5) или (93+7);
- - смеси ацетонитрила и метанола (80+20), (90+10) или (70+30);
- - смесь ацетонитрила, хлороформа и метанола (93+4+3).
Образец сравнения эргокальциферола (витамин D2), М(С28Н44O)=396,7 г/моль. В качестве образца сравнения витамина D2 следует использовать препарат максимально доступной степени чистоты с массовой долей основного вещества более 98%.
Образец сравнения холикальциферола (витамин D3), М(С27Н44O)=384,6 г/моль. В качестве образца сравнения витамина D3 следует использовать препарат максимально доступной степени чистоты с массовой долей основного вещества более 98%.
