Методика выполнения измерений массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола в соках, продуктах переработки плодов и овощей, мёде и мёдсодержащих продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство №44-09 от 08.09.2009, ФР.1.31.2012.13728

1. Объекты исследования

Настоящая методика устанавливает метод измерений массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола в соках, продуктах переработки плодов и овощей, мёде и мёдсодержащих продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Диапазон измерений

Диапазон измерений массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола в объектах указаны в таблице.

Наименование объекта	Диапазон измерений массовой доли 5-гид- роксиметил- фурфурола, мг/кг	Показатель точности (границы относительной погрешности), ±δ, %, при Р=0,95	Показатель повторяемости (относительное среднеквадрати- ческое отклонение повторяемости), σ_r, %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадрати- ческое отклонение воспроизводимости), σ_R , %	Предел повторяемости, r, %, P=0,95, n=2
Сок, продукты переработки плодов и овощей, мёд и мёдсодержащие продукты	от 0,5 до 5 вкл.	35	9	15	25
	свыше 5 до 250 вкл.	25	5	10	14

3. Пробоподготовка

Подготовка проб к измерениям включает следующие этапы:

разбавление пробы дистиллированной водой;
извлечение 5-гидроксиметилфурфурола из пробы методом твердофазной экстракции;
очистка пробы на ТФЭ-картридже;
элюирование 5-гидроксиметилфурфурола с ТФЭ-картриджа и подготовка пробы для ввода в хроматограф.

Для анализа готовят две параллельные пробы.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов 5-гидроксиметилфурфурола и подготовленной пробы

Для хроматографического определения 5-гидроксиметилфурфурола необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с спектрофотометрическим детектором.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы 5-гидроксиметилфурфурола,проводят пробоподготовку, подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

изократический режим;
колонка: «Synergi Hydro-RP» 4 мкм 250х4,6 мм (Phenomenex, США);
защитная колонка: «С18 Aq» или «С18» 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
подвижная фаза: н-гептилсульфонат натрия с молярной концентрацией 5 ммоль/дм³ в растворе ацетонитрил-вода (10:90);
скорость потока: 0,8 см³/мин;
объем петлевого дозатора: 20 мкл;
температура: комнатная;
детектирование: спектрофотометрическое, длина волны 280 нм.

На время удерживания 5-гидроксиметилфурфурола значительное влияние оказывает содержание ацетонитрила в подвижной фазе. Изменение содержания ацетонитрила на 1–2 % может привести к резким колебаниям времени удерживания. В связи с этим градуировку хроматографа и анализ образцов проводят с использованием одного и того же раствора подвижной фазы.

Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят не реже 1 раза в месяц, а также при смене колонки и/или защитной колонки, при замене веществ и/или реактивов; после проведения ремонта хроматографа, после длительного простоя хроматографа (2 недели и более), при изменении эффективности хроматографической системы и/или чувствительности детектора.

4.2. Определение количественного содержания 5-гидроксиметилфурфурола в пробе

Для получения результата измерений проводят анализ двух параллельных проб, для каждой из которых выполняют по два измерения (получают по две хроматограммы). Результат измерений (С) – массовая концентрация 5-гидроксиметилфурфурола в пробе, введенной в хроматограф, рассчитывается автоматически системой сбора и обработки хроматографической информации.

Если массовая концентрация пробы, введенной в хроматограф, оказывается больше верхней границы диапазона градуировки (50 мг/дм³), пробу перед вводом в хроматограф разбавляют подвижной фазой, но не более, чем в 10 раз. Коэффициент разбавления учитывают при расчете.

Рассчитывают среднее арифметическое значение массовой концентрации 5-гидроксиметилфурфурола в пробах, введенных в хроматограф (C₁ и C₂), по результатам двух измерений для каждой из параллельных проб по формуле

С_ср = ( С₁ + С₂ ) / 2

Массовую долю 5-гидроксиметилфурфурола в анализируемой пробе С_пр, [мг/кг] рассчитывают по формуле:

где:
С_ср – среднее значение массовой концентрации 5-гидроксиметилфурфурола в пробе, введенной в хроматограф [мг/дм³];
V₁ – объем пробы при первичной экстракции, см³ (V₁=25,0 см³);
V₂ – объем пробы, взятой на анализ (V₂=4 см³);
V₃ – объем элюата после ТФЭ, см³;
V₄ – объем дистиллированной воды, добавленный к V₃, для получения суммарного объёма элюата 4 см³ ;
M – масса пробы, г (М=5 г);
K_экстр – коэффициент твёрдофазной экстракции (0,85);
K_разб – коэффициент разбавления.

За результат измерений принимают среднее арифметическое значение массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола в двух параллельных пробах.

1. Основное оборудование

Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:

насос изократический в стальном исполнении (SS 316);
детектор спектрофотометрический UVV-105;
устройство ввода образца (ручной инжектор или автосамплер);
дозатор петлевой объемом 20 мкл;
необходимый стартовый набор капилляров, фитингов и уплотнений для сборки системы и обеспечения работы в течение гарантийного периода (в стальном исполнении);
шприц дозирующий Hamilton для ввода образца объёмом 100 мкл;
аналитическая колонка «Synergi Hydro-RP» 250х4,6 мм 4 мкм в комплекте с защитной колонкой «C18» или «С18 Aq» 4х3,0 мм и держателем (Phenomenex);
программное обеспечение для сбора и обработки данных «МультиХром».

2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки

Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
Установка для вакуумной фильтрации и дегазации вместимостью 500 см³ (Phenomenex) или колба Бунзена 2-250-29/32 ТС и воронка Бюхнера по ГОСТ 25336-82.
Насос вакуумный, производительность – 5,5 дм³/мин, разряжение – 160 мбар, или насос, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст., способный работать с органическими растворителями.
Фильтры мембранные фторопластовые (PTFE) и нейлоновые (Nylon), диаметр 45 мм, диаметр пор 0,45 мкм (Phenomenex, США) или фильтры обеззоленные «синяя лента» по ТУ 6-09-1678 (вместо нейлоновых фильтров).
Вакуумная установка для твердофазной экстракции (ТФЭ) в комплекте с адаптером и резервуаром.
Картриджи для твердофазной экстракции Strata-X 100мг/6мл (Phenomenex).

3. Общелабораторное оборудование

Весы лабораторные электронные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, класс точности "специальный" по ГОСТ 24104-2001.
Ванна ультразвуковая, диапазон частоты (20-40) кГц, мощность не менее 50 Вт.
Мешалка магнитная, диапазон скорости вращения (120–1500) об/мин.
Аквадистиллятор по ГОСТ 28165-89.
Шкаф суховоздушный лабораторный ШСвЛ-80 «Касимов».
Пипетки лабораторные стеклянные градуированные, 2 класса точности вместимостью 0,5; 1,0; 2,0 и 5,0 см³ по ГОСТ 29227-91.
Пипетки лабораторные стеклянные концевые градуированные, 2 класса точности вместимостью 2 см³ по ГОСТ 29227-91.
Посуда мерная лабораторная стеклянная 2 класса точности по ГОСТ 1770-74:
- колбы мерные наливные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 см³;
- цилиндры вместимостью 25, 100, 250 см³;
- пробирки с узким дном вместимостью 10 см³.
Склянки из темного стекла с герметично закрывающимися крышками, вместимостью 25, 100 и 500 см³ по ГОСТ 25336-82.
Пробки полиэтиленовые ПП1 КШ 7/16, ПП1 КШ 10/19, ПП1 КШ 14/23 и ПП1 КШ 29/32.
Пробки стеклянные пришлифованные ПМ1 КШ 7/16, ПМ1 КШ 10/19, ПМ1 КШ 14/23 и ПМ1 КШ 29/32 по ГОСТ 25336-82.
Дозаторы медицинские лабораторные переменного объема (пипет-дозаторы) с диапазоном дозирования (1000-5000) мм³ по ГОСТ 28311-89.
Ёмкость для элюента вместимостью 500 см³.

4. Реактивы

Ацетон технический по ГОСТ 2768-84(для мытья посуды).
Ацетонитрил (УФ-200 или УФ-210) для ВЭЖХ, квалификации «о.с.ч.» по ТУ 6-09-14-2167, массовая доля ацетонитрила 99,9%.
Кислота серная, квалификации «ч.» по ГОСТ 4204-77 (для мытья посуды).
н-Гептилсульфонат натрия, с содержанием основного вещества не менее 99%.
Калий двухромовокислый, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 4220-75 (для мытья посуды).
Вода для лабораторного анализа категории 1 по ГОСТ Р 52501-2005.

5. Стандартные образцы

5-Гидроксиметилфурфурол с содержанием основного вещества не менее 99%, "ALDRICH", кат. № Н4,080-7.

Название	Колонка	Детектор
5-Гидроксиметилфурфурол в пробе мёда	Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм	Спектрофотометрический

Адрес производства:

Отдел сервиса и ремонта:

Cклад: