Методика выполнения измерений массовой доли дезоксиниваленола в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Свидетельство №33-08 от 04.03.2008, ФР.1.31.2008.04631
1. Объекты исследования
Настоящая методика выполнения измерений распространяется на муку пшеничную, в т.ч. макаронные изделия, ржаную, тритикалевую, кукурузную, ячменную, просяную (пшенную), рисовую, гречневую, сорговую; бараночные, сухарные изделия; хлеб и хлебобулочные изделия (булки); кондитерские изделия (пирожные, торты); сою, пряности, орехи, семечки; ячменную муку, крупу, хлопья; и устанавливает метод определения массовой концентрации дезоксиниваленола при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием спектрофотометрического определения.
2. Диапазон измерений
Значение ПДК для дезоксиниваленола в муке пшеничной, в т.ч. макаронных изделиях, ржаной, тритикалевой, кукурузной, просяной (пшенной), рисовой, гречневой, сорговой, орехах, кондитерских изделиях (торты, пирожные), бараночных, сухарных изделиях, хлебе и хлебобулочных изделиях (булки) согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 (п. 1.4.4) составляет 0,7 мг/кг (700 мкг/кг). Значение ПДК для дезоксиниваленола в муке ячменной, крупе ячменной, ячменных хлопьях согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 (пп. 1.4.3, 1.4.4) составляет 1,0 мг/кг (1000 мкг/кг).
Данная методика позволяет определять содержание дезоксиниваленола в продуктах питания в концентрациях от 0,35 до 2,0 мг/кг (350 – 2000 мкг/кг).
3. Пробоподготовка
Для анализа дезоксиниваленола используют свободные от посторонних примесей и продуктов жизнедеятельности животных и микроорганизмов (плесени) пробы.
Твердые изделия (макароны, сушки, сухари) предварительно измельчают в блендере до состояния гомогенной массы.
Орехи, кондитерские изделия (торты, пирожные), хлеб и хлебобулочные изделия (булки) для обеспечения однородности пробы и удаления избыточной влаги смешивают с натрием сернокислым в соотношении 1:3 (по массе) и измельчают в блендере до состояния гомогенной массы.
Пробы муки (различных сортов) и пряностей в виде порошка (перец, корица) не требуют предварительного измельчения.
Измельченную (гомогенизированную) пробу продукта экстрагируют хлористым метиленом, используя УЗ-ванну, в колбе с полиэтиеновой пробкой. Колбу с экстрактом помещают в холодильной камеру (температура +5°С) для осаждения твердых частиц. После осаждения твердого слоя верхний слой (супернатант) декантируют в центрифужные пробирки и центрифугируют. Супернатанты из центрифужных пробирок фильтруют в мерный стеклянный цилиндр с помощью пластикового одноразового шприца через уплотненную в шприце пробку из фильтровальной бумаги. Фильтрат отдувают до заданного объема, приливают заданный объем гексана, содержимое цилиндра перемешивают с помощью УЗ-ванны. Полученный раствор подвергают очистке с помощью твердофазной экстракции на картриджах strata NH2. Собранный элюат оставляют при комнатной температуре на время не менее чем 20 мин.
Блок-схема процедуры пробоподготовки
4. Проведение хроматографического анализа
4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов дезоксиниваленола, подготовленной пробы продукта.
Для хроматографического определения дезоксиниваленола необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему со спектрофотометрическим детектированием.
Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы из ГСО дезоксиниваленола в ацетонитриле* или из ГСО дезоксиниваленола в смеси бензол – ацетонитрил (98:2)*; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.
* Для приготовления градуировочных растворов ГСО растворяют в 20 мМ растворе дигидроортофосфата калия и далее в растворе подвижной фазы.
Оборудование:
- хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
- персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».
Условия:
- изократический режим;
- колонка: Synergi Hydro-RP 250х4,6 мм 4 мкм (Phenomenex, США);
- защитная колонка: С18, 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
- подвижная фаза раствор дигидроортофосфата калия KH2PO4 (20 мМ) в смеси ацетонитрил – вода (1:9);
- скорость потока: 0,9 мл/мин;
- объем петли: 20 мкл;
- температура: 50°С;
- детектирование: спектрофотометрическое, длина волны 222 нм.
Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят не реже 1 раза в 2 недели, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.
4.2. Определение количественного содержания дезоксиниваленола в пробе продукта
Для определения количественного содержания компонента пробы (дезоксиниваленола) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.
При использовании программного обеспечения «МультиХром» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации в пробе, введенной в хроматограф (но не в исходном образце, взятом для исследования!).
Для получения результата необходимо провести как минимум два параллельных измерения (получить две хроматограммы). За результат измерений принимают среднее арифметическое значение дезоксиниваленола в концентрате анализируемой пробы Cхр, мкг/л.
Массовую концентрацию дезоксиниваленола в анализируемой пробе (в исходном образце) Х, мкг/кг рассчитывают по формуле:
где:
Схр – среднее значение концентрации дезоксиниваленола, полученное в результате хроматографирования в двух параллельных измерениях [нг/мл];
V1 – объем исходного экстракта, фактически равный объему хлористого метилена, взятого для первичной экстракции (60 мл) [мл];
V2 – объем отфильтрованного экстракта (фильтрата), взятого для дальнейшей обработки, (25 мл) [мл];
V3 – объем элюата после проведения ТФЭ (около 1,5 мл, объем необходимо измерить мерной градуированной стеклянной концевой пипеткой на 2 мл) [мл];
Kэкстр.1 – коэффициент первичной жидкостной экстракции хлористым метиленом;
KТФЭэкстр.2 – коэффициент твердофазной экстракции дезоксиниваленола;
mпр. – масса пробы продукта, взятого на анализ [г].
1. Основное оборудование
Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:
- насос изократический в стальном исполнении (SS 316);
- детектор спектрофотометрический UVV-105;
- устройство ввода образца (ручной инжектор или автосамплер);
- термостат колонок TSС-003;
- дозатор петлевой объемом 20 мкл;
- необходимый стартовый набор капилляров, фитингов и уплотнений для сборки системы и обеспечения работы в течение гарантийного периода (в стальном исполнении);
- шприц дозирующий Hamilton для ввода образца объёмом 100 мкл;
- аналитическая колонка Synergi Hydro-RP 250х4,6 мм 4 мкм в комплекте с защитной колонкой C18 или С18 Aq 4х3,0 мм и держателем (Phenomenex);
- программное обеспечение для сбора и обработки данных «МультиХром» версии 1.5.
2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки
- Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
- Устройство для фильтрации и дегазации растворов и фильтры мембранные (нейлоновые). Предназначены для подготовки подвижной фазы в хроматографическом анализе, подключаются к водоструйному или вакуумному насосу.
- Вакуумная установка для твердофазной экстракции (ТФЭ) в комплекте с адаптером и резервуаром.
- Насос вакуумный, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст. и способный работать с органическими растворителями (например, мининасос-компрессор KNF модель N 86 KT 18).
- Картриджи для твердофазной экстракции strata NH2 500мг/3мл для очистки экстрактов образцов 50 шт. в упаковке (в комплекте на 20 определений – 1 упаковка; в комплекте на 100 определений – 4 упаковки).
- Измельчитель (блендер) 22000 об/мин с объемом стакана 250 мл (например, “Waring”)
3. Общелабораторное оборудование
- Аналитические весы предел взвешивания 200 г, цена деления 0.1 мг с внешней калибровкой (например, весы аналитические AR2140).
- УЗ ванна объемом не менее 5 л, с таймером, и возможностью нагрева, диапазон частоты 20 – 40 кГц, суммарная полезная мощность усилителя не менее 50 Вт (например, «Сапфир»).
- Центрифуга со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин (например ОПН-8, ротор РУ-180Л).
- Дистиллятор.
- Устройство для отдувки образцов в токе воздуха (испарительный концентратор).
- Компрессор безмаслянный производительность от 100 л/ч.
- Комплект лабораторной посуды:
| № п/п | Описание | Коли- чество |
|---|---|---|
| 1 | Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169 2-го класса точности вместимостью 1,0 см3 5,0 см3 10,0 см3 |
3 шт. 3 шт. 3 шт. |
| 2 | Пипетка мерная градуированная лабораторная концевая стеклянная вместимостью 2,0 см3 | 2 шт. |
| 3 | Колбы мерные наливные по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 10 см3 50 см3 250 см3 1000 см3 |
5 шт. 1 шт. 1 шт. 1 шт. |
| 4 | Цилиндр мерный по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 25 см3 50 см3 100 см3 250 см3 |
2 шт. 1 шт. 1 шт. 1 шт. |
| 5 | Пробирка мерная стеклянная градуированная с узким дном по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 10 см3 | 5 шт. |
| 6 | Колба стеклянная коническая 29/32 со шлифом вместимостью 25 см3 250 см3 |
1 шт. 1 шт. |
| 7 | Пробка полиэтиленовая 29/32 | 1 шт. |
| 8 | Пробка стеклянная со шлифом 14/23 | 1 шт. |
| 9 | Стеклянная емкость для подвижной фазы объемом 500 или 1000 см3 | 1 шт. |
| 10 | Емкости (виалы) из темного стекла с герметично закрывающимися крышками объёмом 10 см3 | 3 шт. |
| 11 | Палочка стеклянная | 1 шт. |
| 12 | Шприц медицинский пластиковый двухкомпонентный одноразовый на 5 мл |
1 шт. |
| 13 | Шприц медицинский пластиковый двухкомпонентный одноразовый на 20 мл |
1 шт. |
| 15 | Механическое дозирующее устройство (Pumpipet) | 1 шт. |
| 16 | Пипет-дозатор переменного объема 20-200 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) | 1 шт. |
| 17 | Пипет-дозатор переменного объема 200-1000 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) | 1 шт. |
4. Комплект реактивов на 20 или 100 определений
| № п/п |
Описание | Количество на 20 определений |
Количество на 100 определений |
|---|---|---|---|
| 1 | Ацетонитрил УФ 210, х.ч. | 1 кг | 1 кг |
| 2 | Тетрагидрофуран, х.ч. * | 0.5 кг | 1 кг |
| 3 | Метиленхлорид, х.ч. | 3 кг | 15 кг |
| 4 | н-Гексан, х.ч. | 0.5 кг | 2.5 кг |
| 5 | Натрий сернокислый безводный, х.ч. | 3 кг | 15 кг |
| 6 | Калия дигидрофосфат, х.ч. | 10 г (мин. фасовка) | 50 г (мин. фасовка) |
* Применяется не чаще чем 1 раз на 20 проб для отмывки колонки (в случае необходимости).
5. Комплект стандартных образцов
| № п/п |
Описание | Количество |
|---|---|---|
| 1 | Стандарт дезоксиниваленола (ГСО 7940-2001*) с содержанием дезоксиниваленола 100 мкг/см3 | 1 ампула |
| Название | Колонка | Детектор |
|---|---|---|
| Дезоксиниваленол в пробе муки | Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм | Спектрофотометрический |
| Дезоксиниваленол в пробе орехов арахиса | Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм | Спектрофотометрический |
| Стандартный раствор дезоксиниваленола | Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм | Спектрофотометрический |
