Методика выполнения измерений массовой доли меламина в молоке, сухих молочных смесях, сливках, сметане, йогуртах и кисло-молочных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Свидетельство №45-09 от 10.09.2009, ФР.1.31.2012.13729
1. Объекты исследования
Настоящая методика устанавливает метод измерений массовой концентрации меламина в молоке, сухих молочных смесях, сливках, сметане, йогуртах и кисломолочных продуктах с содержанием жира до 15% методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2. Диапазон измерений
Диапазоны измерений массовой доли меламина в различных объектах указаны в таблице.
| Наименование объекта |
Диапазон измерений массовой доли меламина, мг/кг |
Показатель точности (границы относительной погрешности), ±δ, %, при Р=0,95 |
Показатель повторяемости (относительное среднеквадрати- ческое отклонение повторяемости), σr, % |
Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадрати- ческое отклонение воспроизводимости), σR , % |
Предел повторяемости, r, %, P=0,95, n=2 |
|---|---|---|---|---|---|
| Молоко, сухие молочные смеси, сливки, сметана, йогурты, кисломолочные продукты |
от 0,25 до 1,0 вкл. |
43 | 14 | 22 | 39 |
| свыше 1,0 до 5,0 вкл. |
30 | 9 | 14 | 25 | |
| свыше 1,0 до 5,0 вкл. |
22 | 5 | 9 | 14 |
3. Пробоподготовка
Подготовка проб к измерениям включает следующие этапы:
- первичное извлечение меламина из пробы;
- экстракция меламина из пробы методом твердофазной экстракции;
- очистка пробы на ТФЭ-картридже;
- элюирование меламина с ТФЭ-картриджа и подготовка пробы для ввода в хроматограф.
Для анализа готовят две параллельные пробы.
Блок-схема процедуры пробоподготовки
4. Проведение хроматографического анализа
4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов меламина и подготовленной пробы
Для хроматографического определения меламина необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с спектрофотометрическим детектором.
Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы меламина; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.
Оборудование:
- хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
- персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».
Условия:
- изократический режим;
- колонка: «Synergi Hydro-RP» 4 мкм 250х4,6 мм (Phenomenex, США);
- защитная колонка: «С18 Aq» или «С18» 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
- подвижная фаза: раствор н-гептилсульфоната натрия с молярной концентрацией 10 ммоль/дм3 в 1%-ной водной фосфорной кислоте – ацетонитрил (91:9);
- скорость потока: 0,9 см3/мин;
- объем петлевого дозатора: 20 мкл;
- температура: комнатная;
- детектирование: спектрофотометрическое, длина волны 234 нм.
На время удерживания меламина значительное влияние оказывает содержание ацетонитрила в подвижной фазе. Изменение содержания ацетонитрила на 1–2 % может привести к резким колебаниям времени удерживания. В связи с этим градуировку хроматографа и анализ образцов проводят с использованием одного и того же раствора подвижной фазы.
Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят не реже 1 раза в месяц, а также при смене колонки и/или защитной колонки, при замене веществ и/или реактивов; после проведения ремонта хроматографа, после длительного простоя хроматографа (2 недели и более), при изменении эффективности хроматографической системы и/или чувствительности детектора.
4.2. Определение количественного содержания меламина в пробе
Для получения результата измерений проводят анализ двух параллельных проб, для каждой из которых выполняют по два измерения (получают по две хроматограммы). Результат измерений (С) – массовая концентрация меламина в пробе, введенной в хроматограф, рассчитывается автоматически системой сбора и обработки хроматографической информации.
Если массовая концентрация пробы, введенной в хроматограф, оказывается больше верхней границы диапазона градуировки 50 мкг/см3), пробу перед вводом в хроматограф разбавляют подвижной фазой, но не более, чем в 10 раз. Коэффициент разбавления учитывают при расчете.
Рассчитывают среднее арифметическое значение массовой концентрации меламина в пробах, введенных в хроматограф (C1 и C2), по результатам двух измерений для каждой из параллельных проб по формуле
Сср = ( С1 + С2 ) / 2
Массовую долю меламина в анализируемой пробе Спр, [мг/кг] рассчитывают по формуле:
где:
Сср – среднее значение массовой концентрации меламина в пробе, введенной в хроматограф [мкг/см3];
m2 – масса первичного экстракта, [г];
V1 – объём конечного экстракта [см3];
Kэкстр – коэффициент твёрдофазной экстракции (0,5-0,6);
Kразб – коэффициент разбавления.
За результат измерений принимают среднее арифметическое значение массовой доли меламина в двух параллельных пробах.
1. Основное оборудование
Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:
- насос изократический в стальном исполнении (SS 316);
- детектор спектрофотометрический UVV-105;
- устройство ввода образца (ручной инжектор или автосамплер);
- дозатор петлевой объемом 20 мкл;
- необходимый стартовый набор капилляров, фитингов и уплотнений для сборки системы и обеспечения работы в течение гарантийного периода (в стальном исполнении);
- шприц дозирующий Hamilton для ввода образца объёмом 25 мкл;
- аналитическая колонка Gemini C18 150х4,6 мм 3 мкм в комплекте с защитной колонкой C18 или С18 Aq 4х3,0 мм и держателем защитных колонок;
- программное обеспечение для сбора и обработки данных «МультиХром».
2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки
- Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
- Установка для вакуумной фильтрации и дегазации вместимостью 500 см3 (Phenomenex) или колба Бунзена 2-250-29/32 ТС и воронка Бюхнера по ГОСТ 25336-82.
- Насос вакуумный, производительность – 5,5 дм3/мин, разряжение – 160 мбар, или насос, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст., способный работать с органическими растворителями.
- Фильтры мембранные фторопластовые (PTFE) и нейлоновые (Nylon), диаметр 45 мм, диаметр пор 0,45 мкм (Phenomenex, США) или фильтры обеззоленные «синяя лента» по ТУ 6-09-1678 (вместо нейлоновых фильтров).
- Испарительный концентратор ECTS 10_1;
- Вакуумная установка для твердофазной экстракции (ТФЭ) в комплекте с адаптером и резервуаром.
- Картриджи для твердофазной экстракции Strata-X-C 60мг/3мл (Phenomenex).
3. Общелабораторное оборудование
- Весы лабораторные электронные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, класс точности "специальный" по ГОСТ 24104-2001.
- Ванна ультразвуковая, диапазон частоты (20-40) кГц, мощность не менее 50 Вт.
- Мешалка магнитная, диапазон скорости вращения (120–1500) об/мин.
- Центрифуга «ОПН-8» со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин и пластиковыми пробирками объемом не менее 25 см3.
- Аквадистиллятор по ГОСТ 28165-89.
- Шкаф суховоздушный лабораторный ШСвЛ-80 «Касимов».
- Пипетки лабораторные стеклянные градуированные, 2 класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см3 по ГОСТ 29227-91.
- Пипетки лабораторные стеклянные концевые градуированные, 2 класса точности вместимостью 2 см3 по ГОСТ 29227-91.
- Посуда мерная лабораторная стеклянная 2 класса точности по ГОСТ 1770-74:
- колбы мерные наливные вместимостью 10, 25, 100, 200, 1000 и 2000 см3;
- цилиндры вместимостью 25, 100, 250 см3;
- пробирки с узким дном вместимостью 10 см3.
- Колбы конические КН-1-25-14/23 и КН-1-250-29/32 по ГОСТ 25336-82.
- Склянки из темного стекла с герметично закрывающимися крышками, вместимостью 10 и 25 см3 по ГОСТ 25336-82.
- Пробки полиэтиленовые ПП1 КШ 7/16, ПП1 КШ 10/19, ПП1 КШ 14/23 и ПП1 КШ 29/32.
- Пробки стеклянные пришлифованные ПМ1 КШ 7/16, ПМ1 КШ 10/19, ПМ1 КШ 14/23 и ПМ1 КШ 29/32 по ГОСТ 25336-82.
- Дозаторы медицинские лабораторные переменного объема (пипет-дозаторы) с диапазоном дозирования (1000-5000) мм3 по ГОСТ 28311-89.
- Ёмкость для элюента вместимостью 500 см3.
4. Реактивы
- Ацетон технический по ГОСТ 2768-84(для мытья посуды).
- Ацетонитрил (УФ-200 или УФ-210) для ВЭЖХ, квалификации «о.с.ч.» по ТУ 6-09-14-2167, массовая доля ацетонитрила 99,9 %.
- Кислота фосфорная орто, квалификации "ч.д.а.", ГОСТ 6552.
- н-Гептилсульфонат натрия, с содержанием основного вещества не менее 99%.
- Кислота лимонная, квалификации "о.с.ч." по ТУ 6-09-584-75.
- Аммиак водный 25%-ный, квалификации "о.с.ч." по ГОСТ 24147-80.
- Калий двухромовокислый, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 4220-75 (для мытья посуды).
- Кислота серная, квалификации «ч.» по ГОСТ 4204-77 (для мытья посуды).
- Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
5. Стандартные образцы
- Меламин с содержанием основного вещества более 99%.
| Название | Колонка | Детектор |
|---|---|---|
| Меламин в пробе сливок | Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм | Спектрофотометрический |
