Методика выполнения измерений массовой доли охратоксина А в пищевых продуктах, продовольственном сырье и комбикормах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Свидетельство №42-09 от 21.08.2009, ФР.1.31.2012.13727
1. Объекты исследования
Настоящая методика устанавливает метод измерений массовой доли охратоксина А в зерне, зерновых, крупяных, зернобобовых и масличных культурах, муке, крупе, хлебе, хлебобулочных и макаронных изделиях, орехах, комбикормах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2. Диапазон измерений
Диапазоны измерений массовой концентрации охратоксина А в различных объектах указаны в таблице.
| Наименование объекта |
Диапазон измерений массовой доли охра- токсина А, мг/кг |
Показатель точности (границы относительной погрешности), ±δ, %, при Р=0,95 |
Показатель повторяемости (относительное среднеквадрати- ческое отклонение повторяемости), σr, % |
Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадрати- ческое отклонение воспроизводимости), σR , % |
Предел повторяемости, r, %, P=0,95, n=2 |
|---|---|---|---|---|---|
| Зерно, зерновые, крупяные, зернобобовые и масличные культуры, мука, крупа, хлеб, хлебобулочные и макаронные изделия, орехи, комбикорма |
от 0,0005 до 0,005 вкл. |
35 | 10 | 15 | 28 |
| свыше 0,005 до 0,02 вкл. |
25 | 5 | 10 | 15 |
3. Пробоподготовка
Подготовка проб к измерениям включает следующие этапы:
- первичное извлечение охратоксина А из пробы;
- экстракция охратоксина А из пробы методом твердофазной экстракции;
- очистка пробы на ТФЭ-картридже;
- – элюирование охратоксина А с ТФЭ-картриджа и подготовка пробы для ввода в хроматограф.
Для анализа готовят две параллельные пробы.
Блок-схема процедуры пробоподготовки
4. Проведение хроматографического анализа
4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов охратоксина А и подготовленной пробы
Для хроматографического определения охратоксина А необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с флуориметрическим детектором.
Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы охратоксина А, проводят пробоподготовку, подготавливают к работе прибор.
Оборудование:
- хроматограф жидкостный «Стайер М» с флуориметрическим детектором;
- персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».
Условия:
- изократический режим;
- колонка: «Synergi Hydro-RP» 4 мкм 250х4,6 мм (Phenomenex, США);
- защитная колонка: «С18 Aq» или «С18» 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
- подвижная фаза: раствор аммония хлористого молярной концентрации 20 ммоль/дм3, pH 9,6–9,8 – ацетонитрил (81,5:18,5);
- скорость потока: 0,75 см3/мин;
- объем петлевого дозатора: 20 мкл;
- температура: комнатная;
- детектирование: флуориметрическое, λex 365±2 нм, λem 405-600 нм.
Градуировку проводят по градуировочным растворам во всем диапазоне измеряемых концентраций не реже 1 раза в месяц, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.
4.2. Определение количественного содержания охратоксина А в пробе
Для получения результата измерений проводят анализ двух параллельных проб, для каждой из которых выполняют по два измерения (получают по две хроматограммы). Результат измерений (С) – массовая концентрация охратоксина А в пробе, введенной в хроматограф, рассчитывается автоматически системой сбора и обработки хроматографической информации.
Если массовая концентрация пробы, введенной в хроматограф, оказывается больше верхней границы диапазона градуировки (50 нг/см3), пробу перед вводом в хроматограф разбавляют подвижной фазой, но не более, чем в 10 раз. Разбавление учитывают при расчете.
Рассчитывают среднее арифметическое значение массовой концентрации охратоксина А в пробах, введенных в хроматограф (C1 и C2), по результатам двух измерений для каждой из параллельных проб по формуле
Сср = ( С1 + С2 ) / 2
Массовую долю охратоксина А в анализируемой пробе Спр, [мг/кг] рассчитывают по формуле:
{IMAGE3} где:
Сср – среднее значение массовой концентрации охратоксина А в пробе, введенной в хроматограф [нг/см3];
V1 – объем толуолового экстракта 50 см3;
V2 – объем пробы, взятой на анализ 25 см3;
V3 – измеренный объем пробы [см3];
M – масса пробы 10 г;
Kэкстр – коэффициент твёрдофазной экстракции 0,75;
10-3 – коэффициент пересчета в мг/кг;
Kразб – коэффициент разбавления.
За результат измерений принимают среднее арифметическое значение массовой доли охратоксина А в двух параллельных пробах.
1. Основное оборудование
Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:
- насос изократический в стальном исполнении (SS 316);
- детектор флуориметрический DFL-203;
- устройство ввода образца (ручной инжектор или автосамплер);
- дозатор петлевой объемом 20 мкл;
- необходимый стартовый набор капилляров, фитингов и уплотнений для сборки системы и обеспечения работы в течение гарантийного периода (в стальном исполнении);
- шприц дозирующий Hamilton для ввода образца объёмом 100 мкл;
- аналитическая колонка «Synergi Hydro-RP» 250х4,6 мм 4 мкм в комплекте с защитной колонкой «C18» или «С18 Aq» 4х3,0 мм и держателем (Phenomenex);
- программное обеспечение для сбора и обработки данных «МультиХром».
2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки
- Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
- Установка для вакуумной фильтрации и дегазации вместимостью 500 см3 (Phenomenex) или колба Бунзена 2-250-29/32 ТС и воронка Бюхнера по ГОСТ 25336-82.
- Насос вакуумный, производительность – 5,5 дм3/мин, разряжение – 160 мбар, или насос, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст., способный работать с органическими растворителями.
- Фильтры мембранные фторопластовые (PTFE) и нейлоновые (Nylon), диаметр 45 мм, диаметр пор 0,45 мкм (Phenomenex, США) или фильтры обеззоленные «синяя лента» по ТУ 6-09-1678 (вместо нейлоновых фильтров).
- Вакуумная установка для твердофазной экстракции (ТФЭ) в комплекте с адаптером и резервуаром.
- Картриджи для твердофазной экстракции Strata NH2 60мг/3мл (Phenomenex).
3. Общелабораторное оборудование
- Весы лабораторные электронные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, класс точности "специальный" по ГОСТ 24104-2001.
- Ванна ультразвуковая, диапазон частоты (20-40) кГц, мощность не менее 50 Вт.
- Мешалка магнитная, диапазон скорости вращения (120–1500) об/мин.
- Центрифуга «ОПН-8» со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин и пластиковыми пробирками объемом не менее 25 см3.
- рН-метр HI 9321, "Hanna Instruments".
- Аквадистиллятор по ГОСТ 28165-89.
- Шкаф суховоздушный лабораторный ШСвЛ-80 «Касимов».
- Пипетки лабораторные стеклянные градуированные, 2 класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см3 по ГОСТ 29227-91.
- Пипетки лабораторные стеклянные концевые градуированные, 2 класса точности вместимостью 2 см3 по ГОСТ 29227-91.
- Посуда мерная лабораторная стеклянная 2 класса точности по ГОСТ 1770-74:
- колбы мерные наливные вместимостью 10, 25, 50, 100, 500 и 1000 см3;
- цилиндры вместимостью 25, 50, 100, 200, 250 и 1000 см3;
- пробирки с узким дном вместимостью 10 см3.
- Колбы конические КН-1-25-14/23 и КН-1-250-29/32 по ГОСТ 25336-82.
- Стаканы лабораторные стеклянные В(Н)-1-1000 ТС со шкалой по ГОСТ 25336-82 или стаканы лабораторные стеклянные вместимостью 1000 см3 по ISO 3819.
- Склянки из темного стекла с герметично закрывающимися крышками, вместимостью 25, 50, 500 и 1000 см3 по ГОСТ 25336-82.
- Пробки полиэтиленовые ПП1 КШ 7/16, ПП1 КШ 10/19, ПП1 КШ 14/23 и ПП1 КШ 29/32.
- Пробки стеклянные пришлифованные ПМ1 КШ 7/16, ПМ1 КШ 10/19, ПМ1 КШ 14/23 и ПМ1 КШ 29/32 по ГОСТ 25336-82.
- Пипетки Мора вместимостью 25 см3 2 класса точности по ГОСТ 29227–91.
- Ёмкость для элюента вместимостью 500 см3.
4. Реактивы
- Ацетон технический по ГОСТ 2768-84(для мытья посуды).
- Ацетонитрил (УФ-200 или УФ-210) для ВЭЖХ, квалификации «о.с.ч.» по ТУ 6-09-14-2167, массовая доля ацетонитрила 99,9 %.
- Толуол, квалификации «ч.д.а.» по ГОСТ 5789-78.
- Гексан, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 2631-003-05807999-98.
- Кислота соляная, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 3118-77.
- Кислота уксусная ледяная, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 61-75.
- Аммиак водный, квалификации «о.с.ч.» по ГОСТ 24147-80.
- Магний хлористый шестиводный по ГОСТ 4209-77.
- Натрий сернокислый безводный, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 4166-78.
- Аммоний хлористый, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 3773-72.
- Калий двухромовокислый, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 4220-75 (для мытья посуды).
- Кислота серная, квалификации «ч.» по ГОСТ 4204-77 (для мытья посуды).
- Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
5. Стандартные образцы
- Раствор охратоксина А (СОП 0015-97) в ацетонитриле с аттестованным значением массовой концентрации 50,0 мкг/см3 ± 5%
| Название | Колонка | Детектор |
|---|---|---|
| Охратоксин А в пробе зерна | Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм | Флуориметрический |
