Методика выполнения измерений массовой доли зеараленона в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

1. Объекты исследования

Настоящая методика выполнения измерений распространяется на муку пшеничную, в т.ч. макаронные изделия, ржаную, тритикалевую, кукурузную, ячменную, просяную (пшенную), рисовую, гречневую, сорговую; бараночные, сухарные изделия; хлеб и хлебобулочные изделия (булки); кондитерские изделия (пирожные, торты); сою, пряности, орехи, семечки; ячменную муку, крупу, хлопья; и устанавливает метод определения массовой концентрации зеараленона при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием спектрофотометрического определения.

2. Диапазон измерений

Значение ПДК для зеараленона в муке пшеничной, в т.ч. макаронных изделиях, ржаной, тритикалевой, кукурузной, просяной (пшенной), рисовой, гречневой, сорговой, ячменной, крупе ячменной, ячменных хлопьях, орехах, кондитерских изделиях (торты, пирожные), бараночных, сухарных изделиях, хлебе и хлебобулочных изделиях (булках), согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 (п. 1.4.4.), составляет 0,2 мг/кг (200 мкг/кг).

Данная методика позволяет определять содержание зеараленона в продуктах питания в концентрациях от 0,1 до 0,8 мг/кг (100 – 800 мкг/кг).

3. Пробоподготовка

Для анализа зеараленона используют свободные от посторонних примесей и продуктов жизнедеятельности животных и микроорганизмов (плесени) пробы.

Твердые изделия (макароны, сушки, сухари) предварительно измельчают в блендере до состояния гомогенной массы.

Орехи, кондитерские изделия (торты, пирожные), хлеб и хлебобулочные изделия (булки) для обеспечения однородности пробы и удаления избыточной влаги смешивают с натрием сернокислым в соотношении 1:3 (по массе) и измельчают в блендере до состояния гомогенной массы.

Пробы муки (различных сортов) и пряностей в виде порошка (перец, корица) не требуют предварительного измельчения.

Пробу продукта (измельченную, гомогенизированную) экстрагируют этилацетатом в колбе с полиэтиленовой пробкой, используя УЗ-ванну; колбу оставляют при комнатной температуре на 20 мин для осаждения осадка, верхний слой (супернатант) декантируют и фильтруют через пробку из фильтровальной бумаги и фильтрующую насадку PTFE с помощью одноразового пластикового шприца в мерный стеклянный цилиндр, фильтрат отдувают до заданного объема, приливают гексан и перемешивают содержимое цилиндра при помощи УЗ-ванны. Полученный раствор подвергают очистке с помощью твердофазной экстракции на картриджах Strata NH₂, собранный элюат оставляют при комнатной температуре на время не менее, чем 10 мин.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

Таблица 1. Объемы этилацетата (V1), необходимые для первичной жидкостной экстракции зеараленона из различных продуктов

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов зеараленона, подготовленной пробы продукта.

Для хроматографического определения зеараленона необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему со спектрофотометрическим детектированием.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы из СОП зеараленона в ацетонитриле или из СОП зеараленона в смеси бензол – ацетонитрил (98:2); проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

• хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
• персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

• изократический режим;
• колонка: Synergi Hydro-RP 4 мкм 250х4,6 мм или Synergi Hydro-RP 4 мкм 250x3,0 мм (Phenomenex, США);
• защитная колонка: С18 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
• подвижная фаза: смесь ацетонитрил – вода – концентрированная ортофосфорная кислота (60:40:1);
• скорость потока: 0,9 мл/мин (или 0,4 мл/мин при использовании колонок Synergi Hydro-RP 250х3,0 мм);
• объем петли: 20 мкл;
• температура: 50°С;
• детектирование: спектрофотометрическое, длина волны 280 нм.

Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят не реже 1 раза в 2 недели, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение количественного содержания зеараленона в пробе продукта

Для определения количественного содержания компонента пробы (зеараленона) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.

При использовании программного обеспечения «МультиХром» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации в пробе, введенной в хроматограф (но не в исходном образце, взятом для исследования!).

Для получения результата необходимо провести как минимум два параллельных измерения (получить две хроматограммы). За результат измерений принимают среднее арифметическое значение зеараленона в концентрате анализируемой пробы C_хр, мкг/л.

Массовую концентрацию зеараленона в анализируемой пробе (в исходном образце) Х, мкг/кг рассчитывают по формуле:

где:
С_хр – среднее значение концентрации зеараленона, полученное в результате хроматографирования в двух параллельных измерениях [нг/мл];
V₁ – объем исходного экстракта, фактически равный объему этилацетата, взятого для первичной экстракции (50 или 75 мл, см. табл. 1) [мл];
V₂ – объем отфильтрованного экстракта (фильтрата), взятого для дальнейшей обработки, (25 мл) [мл];
V₃ – объем элюата после проведения ТФЭ, часть из которого вводится в хроматограф (около 1,5 мл) [мл];
K_экстр.1 – коэффициент первичной жидкостной экстракции этилацетатом;
K_{ТФЭэкстр.2} – коэффициент твердофазной экстракции зеараленона;
m_пр. – масса пробы продукта, взятого на анализ [г].