Методика выполнения измерений массовой концентрации афлатоксина М1 в молоке, молочных продуктах и масле коровьем методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

1. Объекты исследования

Настоящая методика выполнения измерений распространяется на молоко, молочные продукты и коровье масло и устанавливает определение массовой концентрации афлатоксина М1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием.

2. Диапазон измерений

Метод обеспечивает получение результатов измерений массовой концентрации афлфтоксина М1 в пробах молока, молочных продуктов и коровьем масле на уровне не менее половины ПДК (0,00025 мг/кг).

ПДК М1 в молоке и продуктах его переработки регламентируется СанПин 1078-01 на уровне 0,0005 мг/кг.

3. Пробоподготовка

Отбор проб производят в чистые тщательно высушенные стеклянные емкости. Пробу взвешивают на аналитических весах (результат взвешивания записывают до четвертого десятичного знака).

Пробу сыра необходимо предварительно мелко измельчить, пробу масла – растопить. Для измельчения можно использовать мелкую кухонную терку.

Навеску сухого молока необходимо предварительно растворить в дистиллированной воде (10 г в 10 мл), подогретой до температуры 40 °С.

Пробоподготовка состоит из этапов отбора пробы; осаждения белка путем первичной экстракции афлатоксина М1 раствором натрия хлористого и лимонной кислоты при подогреве до 30–35°С и последующей экстракции хлороформом (предварительно подогретом до 30–35°С) в конической колбе; центрифугирования; переноса содержимого пробирок (без белкового осадка) в делительную воронку, дополнительной промывки белковых осадков хлороформом и переносе хлороформных слоев в делительную воронку, разделения слоев объединенных супернатантов в делительной воронке, упаривания отделенного хлороформного слоя на роторном испарителе, добавления точных объемов воды дистиллированной и гексана, разделения водного и гексанового слоев в делительной воронке, отделения водного слоя, повторного добавления к водному слою гексана, разделения слоев в делительной воронке; последующей очистки и концентрирования водного слоя (обезжиренного водного экстракта) с добавкой 5% ацетонитрила методом твердофазной экстракции на картриджах Strata C18-E, элюирования, отдувки элюента до заданного объема при температуре не выше 50°С.

Пробы хранят в холодильнике при температуре 4 – 6 °С.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов афлатоксина М1, подготовленной пробы продукта.

Для хроматографического анализа афлатоксина М1 необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с флуориметрическим детекторованием.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы из СО афлатоксина М1 в ацетонитриле или из СО афлатоксина М1 в смеси бензола с ацетонитрилом (растворитель отдувают и перерастворяют стандартный образец в чистом ацетонитриле); проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

• хроматограф жидкостный «Стайер М» с флуориметрическим детектором;
• персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

• изократический режим;
• колонка: Synergi Polar-RP 250х4,6 мм 4 мкм (Phenomenex, США);
• защитная колонка: Polar-RP 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
• подвижная фаза: раствор ацетонитрил/вода (2:3);
• скорость потока: 0,8 мл/мин;
• объем петли: 20 мкл;
• температура: 20°С;
• диапазон RFU: 0,005;
• детектирование: флуориметрическое (λex: 365±2 нм; λem: 400-460 нм).

Градуировку проводят по градуировочным растворам (во всем диапазоне определяемых концентраций) не реже 1 раза в месяц, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение количественного содержания афлатоксина М1 в пробе продукта

Для определения количественного содержания компонента пробы продукта (афлатоксина М1) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.

При использовании программного обеспечения «МультиХром» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации в пробе, введенной в хроматограф (но не в исходном образце, взятом для исследования!).

Для получения результата необходимо провести как минимум два параллельных измерения (получить две хроматограммы). За результат измерений принимают среднее арифметическое значение содержания афлатоксина М1 в концентрате анализируемой пробы, мкг/л.

Массовую концентрацию афлатоксина М1 в анализируемой пробе, мкг/л (в исходном образце) Х, мкг/кг рассчитывают по формуле:

где:
С_хр – среднее значение концентрации афлатоксина М1, полученное в результате хроматографирования в двух параллельных измерениях [мкг/л];
V₁ – объем элюата после проведения ТФЭ и концентрирования, часть из которого вводится в хроматограф (около 2 мл) [мл];
K_пр – коэффициент пробоподготовки в целом, равный 0,85;
m_пр – масса пробы продукта, взятого на анализ (см. таблицу 1) [г].

Таблица 1. Массы навесок образцов и объемы первичного раствора для экстракции.