Методика выполнения измерений массовой концентрации левомицетина в молоке, мясе и яйцах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Свидетельство №01.00225/4-11 от 25.01.2011, ФР.1.31.2012.13730
1. Объекты исследования
Настоящая методика устанавливает метод измерений массовой концентрации левомицетина (антибиотика) в молоке, мясе и яйцах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2. Диапазон измерений
Диапазон измерений массовой доли левомицетина – от 0,005 до 0,1 мг/кг. Метрологические характеристики метода указаны в таблице.
Наименование объекта |
Диапазон измерений массовой доли левомицетина, млн-1 (мг/кг) |
Показатель точности (границы относительной погрешности), ±δ, %, при Р=0,95 |
Показатель повторяемости (относительное среднеквадрати- ческое отклонение повторяемости), σr, % |
Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадрати- ческое отклонение воспроизводимости), σR , % |
Предел повторяемости, r, %, P=0,95, n=2 |
---|---|---|---|---|---|
Молоко, яйцa |
от 0,005 до 0,010 вкл. | 35 | 9 | 14 | 25 |
св. 0,010 до 0,10 вкл. | 22 | 6 | 9 | 17 | |
Мясо | от 0,005 до 0,01 вкл. | 50 | 11 | 17 | 31 |
св. 0,010 до 0,10 вкл. | 34 | 6 | 9 | 17 |
3. Пробоподготовка
Подготовка проб к измерениям включает следующие этапы:
- извлечение (жидкостная экстракция) левомицетина из пробы;
- очистка и концентрирование экстракта;
- подготовка пробы для ввода в хроматограф.
Для анализа готовят две параллельные пробы.
Блок-схема процедуры пробоподготовки
4. Проведение хроматографического анализа
4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов левомицетина и подготовленной пробы
Для хроматографического определения левомицетина необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с спектрофотометрическим детектором.
Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы левомицетина; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.
Оборудование:
- хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
- персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».
Условия:
- изократический режим;
- колонка: Gemini С18 3 мкм 150х4,6 мм;
- защитная колонка: С18 Aq или С18 4x3,0 мм;
- подвижная фаза: 0,2% водный раствор ортофосфорной кислоты–ацетонитрил (70:30);
- скорость потока: 0,7 см3/мин;
- объем петлевого дозатора: 20 мкл;
- температура: 40°С;
- детектирование: спектрофотометрическое, длина волны 280 нм.
Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят не реже 1 раза в месяц, а также при смене колонки и/или защитной колонки, при замене веществ и/или реактивов; после проведения ремонта хроматографа, после длительного простоя хроматографа (2 недели и более), при изменении эффективности хроматографической системы и/или чувствительности детектора.
4.2. Определение количественного содержания левомицетина в пробе
Для получения результата измерений проводят анализ двух параллельных проб, для каждой из которых выполняют по два измерения (получают по две хроматограммы). Результат измерений С (мкг/см3) – массовая концентрация левомицетина в пробе, введенной в хроматограф, рассчитывается автоматически системой сбора и обработки хроматографической информации по площади пика.
Если массовая концентрация пробы, введенной в хроматограф, оказывается больше верхней границы диапазона градуировки (5 мкг/см3), пробу перед вводом в хроматограф разбавляют подвижной фазой. Коэффициент разведения Kразв учитывают при расчете.
Рассчитывают среднее арифметическое значение массовой концентрации левомицетина в пробах, введенных в хроматограф (C1 и C2), по результатам двух измерений для каждой из параллельных проб по формуле
Сср = ( С1 + С2 ) / 2
Массовую долю левомицетина в анализируемой пробе Xпр, [мкг/кг] рассчитывают по формуле:
где:
Сср – среднее значение массовой концентрации левомицетина в пробе, введенной в хроматограф, мкг/см3;
V1 – объем ацетонитрила, взятый для экстракции (10 см3);
V2 – объем экстракта (10 см3);
V3 – объем пробы после концентрирования, см3;
Kразв – коэффициент разведения образца перед введением в хроматограф (при отсутствии разведения равен 1);
Kэкстр – коэффициент извлечения (см. таблицу);
KТФЭ – коэффициент твердофазной экстракции (см. таблицу);
M1 – навеска образца, г.
Мясо | Яйцо | Молоко | Вода | |
Kэкстр | 0,5 | 0,45 | 0,55 | 0,5 |
KТФЭ | 0,55 | 0,75 | 0,9 | 0,9 |
За результат измерений принимают среднее арифметическое значение массовой доли левомицетина в двух параллельных пробах.
1. Основное оборудование
Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:
- насос изократический в стальном исполнении (SS 316);
- детектор спектрофотометрический UVV-105;
- устройство ввода образца (ручной инжектор или автосамплер);
- Термостат колонок TSС-003;
- дозатор петлевой объемом 20 мкл;
- необходимый стартовый набор капилляров, фитингов и уплотнений для сборки системы и обеспечения работы в течение гарантийного периода (в стальном или полимерном исполнении);
- шприц дозирующий Hamilton для ввода образца объёмом 25 мкл;
- аналитическая колонка Gemini C18 150х4,6 мм 3 мкм в комплекте с защитной колонкой C18 или С18 Aq 4х3,0 мм и держателем защитных колонок;
- программное обеспечение для сбора и обработки данных «МультиХром».
2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки
- Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
- Установка для вакуумной фильтрации и дегазации растворов (Phenomenex, США).
- Насос вакуумный (например, мини насос-компрессор KNF модель N 86 KT 18, производительность - 5,5 л/мин, вакуум - 160 мбар, давление до 2,5 бар, фторопластовая мембрана).
- Фильтры мембранные фторопластовые (PTFE), диаметр 45 мм, диаметр пор 0,45 мкм (Phenomenex, США).
- Вакуумная установка для твердофазной экстракции в комплекте с адаптером и резервуаром (Phenomenex, США).
- Картриджи для твердофазной экстракции Strata-X 60мг/3мл (Phenomenex, США).
3. Общелабораторное оборудование
- Весы лабораторные электронные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, класс точности специальный, по ГОСТ 24104-2001 (например, весы аналитические RV214).
- Ванна ультразвуковая ALS, диапазон частоты (20-40) кГц, мощность не менее 50 Вт.
- Центрифуга «ОПн-8» со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин и пластиковыми пробирками объемом не менее 20 см3.
- Встряхиватель пробирок «Вортекс V-3», скорость вращения гнезда не менее 2300 мин–1 (ELMI, Латвия).
- Блендер Waring 800S со стаканом 250 см3 (США).
- Пленка укрывная «Парафильм М» шириной 10 см.
- Комплект лабораторной посуды:
№ п/п | Описание | Коли- чество |
---|---|---|
1 | Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169 2 класса точности, вместимостью 1,0 см3 2,0 см3 10 см3 |
2 шт. 4 шт. 1 шт. |
2 | Колбы мерные наливные 2 класса точности по ГОСТ 1770 вместимостью 50 см3 100 см3 250 см3 500 см3 1000 см3 |
3 шт. 4 шт. 1 шт. 1 шт. 1 шт. |
3 | Цилиндры мерные 2 класса точности по ГОСТ 1770 вместимостью 10 см3 250 см3 |
3 шт. 2 шт. |
4 | Стаканы стеклянные с носиком по ГОСТ 25336-82 вместимостью 100 см3 250 см3 |
1 шт. 1 шт. |
5 | Пробирки типа Эппендорф, градуированные, с крышкой, 1.5 мл | 2 шт. |
6 | Пробирка центрифужная 20 см3 для ротора РУ-180Л. | 3 шт. |
7 | Стеклянная емкость для подвижной фазы объемом 500 или 1000 см3 | 1 шт. |
8 | Палочка стеклянная | 2 шт. |
4. Реактивы
- Ацетонитрил (УФ-200 или УФ-210) для ВЭЖХ, квалификации «о.с.ч.» по ТУ 6-09-14-2167.
- Кислота ортофосфорная для электронной промышленности или квалификации «ч.д.а.».
- Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
5. Стандартные образцы
- Левомицетин (РСО 9348-152-00494189-06) или Сloramphenicol (Sigma, кат. номер C0857) с массовой долей 99%.
Название | Колонка | Детектор |
---|---|---|
Левомицетин стандарт | Gemini C18 150x4.6 мм 3 мкм | Спектрофотометрический |
Левомецитин в яйце | Gemini C18 150x4.6 мм 3 мкм | Спектрофотометрический |
Левомецитин в мясе | Gemini C18 150x4.6 мм 3 мкм | Спектрофотометрический |
Левомицетин в молоке | Gemini C18 150x4.6 мм 3 мкм | Спектрофотометрический |