Методика выполнения измерений массовой концентрации углеводов в напитках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Свидетельство №46-08 от 26.03.2008, ФР.1.31.2008.01035
1. Объекты исследования
Настоящая методика выполнения измерений распространяется на вина виноградные, оригинальные и плодовые, напитки винные и безалкогольные, соки и виноматериалы и устанавливает метод определения массовой концентрации углеводов (сахарозы, глюкозы, фруктозы) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (в частности, с целью установления подлинности напитка, содержащего эти углеводы).
2. Диапазон измерений
Метод обеспечивает получение результатов измерений массовой концентрации сахарозы, глюкозы, фруктозы в пробах напитков в диапазонах измерения 500 – 80000 ppm (мг/л).
3. Пробоподготовка
Отбор проб вина, винных напитков, соков и сокосодержащих напитков, виноматериалов, сусла осуществляют в стеклянные емкости, предварительно вымытые и тщательно высушенные.
Пробоподготовка состоит из стадий отбора пробы, смешивания точного объема пробы с точным объемом спирта изопропилового, процесса твердофазной экстракции смеси на картриджах strata SDB-L.
При наличии взвешенных частиц отобранную пробу предварительно центрифугируют, супернатант (надосадочную жидкость) фильтруют с помощью одноразового шприца через фильтрующую нейлоновую насадку, отбирают точный объем пробы (фильтрата), смешивают с точным объемом спирта изопропилового, смесь подвергают очистке с помощью твердофазной экстракции ТФЭ на картриджах strata SDB-L.
Блок-схема процедуры пробоподготовки
4. Проведение хроматографического анализа
4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов углеводов, подготовленной пробы напитка.
Для хроматографического разделения углеводов необходимо использовать изократическую высокоэффективную хроматографическую систему с рефрактометрическим детектированием.
Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы смеси углеводов из навесок сахарозы, глюкозы моногидрата и фруктозы; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.
Градуировочные растворы готовят и используют в день определения.
Оборудование:
- хроматограф жидкостный «Стайер М» с рефрактометрическим детектором;
- персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».
Условия:
- изократический режим;
- колонка: Rezex RCM-Monosaccharide 300х7,8 мм 8 мкм (Phenomenex, США);
- защитная колонка: Carbo-Ca2+ 4х3,0 мм (Phenomenex, США);
- подвижная фаза: бидистиллированная вод;
- скорость потока: 0,6 мл/мин;
- объем петли: 20 мкл;
- детектирование: рефрактометрическое;
- температура термостата: 85°С
Градуировку проводят по градуировочным растворам (во всем диапазоне определяемых концентраций) не реже 1 раза в квартал, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.
4.2. Определение количественного содержания углеводов в пробе напитка.
Для определения количественного содержания компонентов пробы (сахарозы, глюкозы, фруктозы) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.
При использовании программного обеспечения «МультиХром» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации определяемых углеводов. Для получения результата необходимо провести два параллельных измерения (получить две хроматограммы).
За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.
1. Основное оборудование
Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:
- насос изократический в полимерном исполнении;
- детектор рефрактометрический REF-105;
- устройство ввода образца (ручной инжектор или автосамплер);
- термостат колонок TSС-003;
- необходимый стартовый набор капилляров, фитингов и уплотнений для сборки системы и обеспечения работы в течение гарантийного периода (в полимерном исполнении);
- шприц дозирующий Hamilton для ввода образца объёмом 100 мкл;
- аналитическая колонка Rezex RCM-Monosaccharide 300х7,8 мм 8 мкм в комплекте с защитной колонкой Carbo-Ca+2 4х3,0 мм и держателем (Phenomenex);
- программное обеспечение для сбора и обработки данных «МультиХром».
2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки
- Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
- Устройство для фильтрации и дегазации растворов и фильтры мембранные (фторопластовые). Предназначены для подготовки подвижной фазы в хроматографическом анализе, подключаются к водоструйному или вакуумному насосу.
- Вакуумная установка для твердофазной экстракции (ТФЭ) в комплекте с адаптером и резервуаром.
- Насос вакуумный, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст. и способный работать с органическими растворителями (например, мининасос-компрессор KNF модель N 86 KT 18).
- Картриджи для твердофазной экстракции strata SDB-L 500мг/3мл для очистки экстрактов образцов 50 шт. в упаковке (в комплекте на 20 определений – 1 упаковка; в комплекте на 100 определений – 4 упаковки)
- Фильтрующая насадка на шприц Nylon 0,45 мкм диаметр 30 мм (Phenomenex) для предварительной фильтрации образца.
3. Общелабораторное оборудование
- Аналитические весы предел взвешивания 200 г, цена деления 0.1 мг с внешней калибровкой (например, весы аналитические AR2140).
- УЗ ванна объемом не менее 5 л, с таймером, и возможностью нагрева, диапазон частоты 20 – 40 кГц, суммарная полезная мощность усилителя не менее 50 Вт (например, «Сапфир»).
- Дистиллятор.
- Центрифуга со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин (например ОПН-8, ротор РУ-180Л) и комплектом пластиковых пробирок.
- Комплект лабораторной посуды:
| № п/п | Описание | Коли- чество |
|---|---|---|
| 1 | Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169 2-го класса точности вместимостью 10,0 см3 25,0 см3 50,0 см3 |
3 шт. 3 шт. 3 шт. |
| 2 | Колбы мерные наливные по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 50 см3 100 см3 1000 см3 |
1шт. 3 шт. 2 шт. |
| 3 | Колба стеклянная коническая со шлейфом вместимостью 50 см3 | 2 шт. |
| 4 | Пробирки градуированные 10 см3 | 2 шт. |
| 5 | Шприц медицинский пластиковый двухкомпонентный одноразовый на 5 мл | 1 шт. |
| 6 | Механическое дозирующее устройство (Pumpipet) | 1 шт. |
| 7 | Пипет-дозатор переменного объема 20-200 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) | 1 шт. |
| 8 | Пипет-дозатор переменного объема 200-1000 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) | 1 шт. |
4. Комплект реактивов на 20 или 100 определений
| № п/п |
Описание | Количество на 20 определений |
Количество на 100 определений |
|---|---|---|---|
| 1 | Спирт изопропиловый по ТУ 6-09-07-1718-91, о.с.ч. | 1 кг | 1 кг |
5. Комплект стандартных образцов
| № п/п |
Описание | Количество |
|---|---|---|
| 1 | Сахароза по ГОСТ 5833 - 75, ч.д.а. | 10 г |
| 2 | D(-) фруктоза по ТУ 6-09-1979-77, ч. | 10 г |
| 3 | Глюкоза-моногидрат по ФС 42-2419-86, фарм. | 11 г |
| Название | Колонка | Детектор |
|---|---|---|
| Стандартная смесь углеводов 2 | Rezex RCM-Monosaccharide 300х7.8 мм 8 мкм | Рефрактометрический |
| Углеводы в соке апельсиновом | Rezex RCM-Monosaccharide 300х7.8 мм 8 мкм | Рефрактометрический |
| Углеводы в соке яблочно-земляничном | Rezex RCM-Monosaccharide 300х7.8 мм 8 мкм | Рефрактометрический |
