Ионоэксклюзионная хроматография

Ионоэксклюзионная хроматография является широко известным эффективным методом, вторая волна популярности которой наблюдается в настоящее время. В основе данного механизма разделения лежит эффект доннановского распределения, в результате которого соединения в ионизированной форме не удерживаются на ионообменнике, тогда как соединения в молекулярной форме распределяются между неподвижной водной фазой внутри пор ионообменника и подвижной фазой, мигрирующей в пространстве между частицами сорбента. Разделение основано на электростатическом отталкивании, полярных и гидрофобных взаимодействиях между растворённым соединением и сорбентом.

Механизм разделения в упрощённом виде может быть описан как "отторжение" ионов анионо- или катионообменными сорбентами и удерживание соединений в молекулярной форме за счёт совокупности полярных и гидрофобных взаимодействий. Слой сорбента можно условно разделить на три части: I - твёрдая матрица катионообменного сорбента с анионогенными функциональными группами на поверхности, II - жидкости (молекул воды), находящейся внутри пор сорбента и образующей стационарный "гидрофильный щит", III - подвижной фазы, мигрирующей между частицами сорбента. Анионогенные группы на поверхности сорбента действуют как полупроницаемая "доннановская мембрана" между стационарной (II) и подвижной (III) жидкими фазами. Отрицательно заряженные компоненты не достигают стационарной подвижной фазы II, так как отталкиваются одноимённо заряженными функциональными группами и покидают колонку с "мёртвым" (свободным) объёмом. Компоненты в молекулярном виде не "отторгаются" катионообменным сорбентом и распределяются между стационарной (II) и подвижной (III) жидкими фазами. Различие степени удерживания неионных компонентов смеси продиктовано совокупностью полярных взаимодействий неионных компонентов смеси с функциональными группами катионообменного сорбента и гидрофобных взаимодействий неионных компонентов смеси с неполярной матрицей сорбента.

Подавляющее большинство сорбентов для ионоэксклюзионной хроматографии сделано на основе сульфированного сополимера стирол - дивинилбензола (СДВБ) с высокой ёмкостью и размером частиц 8 - 15 мкм. Дивинилбензол, являющийся сшивающим реагентом, играет значительную роль в удерживании слабоионизированных компонентов. Меньшая степень сшивки (4%) приводит к более высокому доннановскому проникновению электролитов в смолу и, как следствие, более медленному элюированию компонента. В то же время более высокая степень сшивки (8%) обеспечивает дополнительную твёрдость полимерной матрице, благодаря чему удаётся снизить неприятный эффект "разбухания" полимерного сорбента при использовании органического модификатора в элюенте, приводящий к катастрофическому росту обратного давления в хроматографической системе.

Одним из лидеров по производству хроматографических колонок для ионоэксклюзионной хроматографии является компания Phenomenex (США). Колонки марки Rezex ROA-Organic Acid (300 х 7.8 мм, степень сшивки - 8%) широко используются на территории РФ для анализа пищевой продукции. Характерными особенностями колонок данного типа является использование низких линейных скоростей элюирования (0.5 - 0.8 мл/мин) и необходимость избегать использования сильных кислот и оснований, а также органическихрастворителей свыше 10% в качестве элюента. В качестве подвижной фазы чаще всего используют разбавленные (0.0025 - 0.005 N) растворы сильных неорганических кислот - серной или фосфорной. Рекомендуемый диапазон рН элюента: 1-3. Максимально допустимое давление на колонке - 40 бар.

Не смотря на то, что при помощи ионоэксклюзионной хроматографии можно разделять достаточно широкий спектр органических соединений (аминокислоты, сахара, спирты и фенолы), классической областью применения данного механизма разделения является анализ органических кислот в продуктах питания (безалкогольных напитках, соках, винах, виноматериалах и т.д.). Наиболее сильные и ионизированные кислоты, такие как серная, соляная и азотная отталкиваются отрицательным зарядом сульфогруппы и элюируются со свободным объёмом колонки. Более слабые кислоты находятся, как правило, в молекулярном виде и не отторгаются смолой. Компанией "Аквилон" совместно с Коломенским ЦСМ был разработан метод определения массовой концентрации органических кислот (щавелевой, уксусной, лимонной, винной, яблочной, суммы молочной и янтарной) в напитках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1 - лимонная кислота
2 - винная кислота
3 - яблочная кислота
4 - янтарная + молочная кислоты
5 - уксусная кислота

Пример хроматограммы разделения органических кислот в красном столовом вине.
Элюент - 0,005 N раствор серной кислоты, колонка - Rezex ROA-Organic Acid (300x7.8 мм, 8 мкм), детектор спектрофотометрический, длина волны 210 нм.

Ещё одной интересной областью применения ионоэксклюзионной хроматографии является метод контроля ферментативной динамики бражек при производстве спирта, разработанный компанией "Аквилон". Метод основан на одновременном ионоэксклюзионном разделении четырёх классов соединений (олигосахариды, моносахариды, органические кислоты, спирты) и их последовательном рефрактометрическом и спектрофотометрическом детектировании. Метод позволяет отслеживать динамику процесса брожения на спиртовых заводах.

1 - мальтоза
2 - глюкоза
3 - фруктоза
4 - молочная кислота
5 - глицерин
6 - уксусная кислота
7 - метанол
8 - этанол

Пример хроматограммы разделения стандартной смеси.
Элюент - 0,0025 N раствор серной кислоты, колонка - Rezex ROA-Organic Acid (300x7.8 мм, 8 мкм), детектирование - спектрофотометрическое 230 нм (компоненты 4 и 6) и рефрактометрическое (компоненты 1,2,3,5,7,8).