Качество и эффективность колонок

Вид хроматограммы в зависимости от эффективности и селективности хроматографической системы:
а - нормальная селективность, пониженная эффективность; б - нормальная эффективность и селективность; в - повышенная селективность, нормальная эффективность.

Качество хроматографической колонки характеризуют прежде всего ее эффективностью. Она тем выше, чем уже ширина пика при том же времени удерживания. Эффективность колонки измеряется числом теоретических тарелок N. Чем выше эффективность, тем больше величина N. Другими количественными критериями качества колонки являются Н - высота, эквивалентная теоретической тарелке, Н' - приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке, и приведенное число теоретических тарелок N’. Определения и формулы для расчетов параметров эффективности колонки приведены здесь.

Для типовых качественных колонок для ВЭЖХ N' находится в диапазоне значений 50 - 100 тыс. теоретических тарелок на 1 м.

Значения N, N’, Н и Н' позволяют сравнивать эффективность колонок разных типов, разной длины, заполненных разными по природе и зернению сорбентами. Сравнивая N двух колонок одной длины, сопоставляют их эффективность. При сравнении H оценивают качество колонок с сорбентами одинакового зернения, но имеющими разную длину. Наконец, величина Н' позволяет для двух любых колонок оценить качество сорбента, во-первых, и качество заполнения колонок, во-вторых, независимо от длины колонок, размера частиц сорбента и его природы.

Селективность колонки α, а вернее хроматографической системы в целом, играет большую роль в обеспечении надежного хроматографического разделения. Селективность колонки зависит от многих факторов, варьируя которые можно подобрать оптимальные условия хроматографии заданной смеси компонентов.

Исходя из химической природы разделяемых компонентов, хроматографист должен выбрать подходящий состав ПФ и соответствующий по химической природе сорбент. Таким образом, селективность колонки всегда относительна. Она зависит от элюента, типа сорбента, определенное влияние на нее имеют и такие термодинамические факторы, как температура и давление в колонке, изменяющее коэффициенты распределения веществ между ПФ и НФ. Подбор оптимальной селективности является обязательным предметом теоретических и практических изысканий хроматографистов при разработке и воспроизведении методик.

Фактор удерживания k, не зависит от большинства экспериментальных условий, однако на него сильно влияет фазовое отношени,а следовательно, качество упаковки сорбента в колонке. В первом приближении фактор удерживания экспериментально определяют, как отношение разности времени удерживания конкретного сорбата к времени удерживания несорбируемого соединения.

k = (t_R - t_o) / t_o

Время выхода несорбируемого соединения t_o можно выразить величиной, равной длине колонки L, деленной на скорость подвижной фазы u.

t_R=(1+k)L/u

Это уравнение показывает, как связано удерживание с равновесием, длиной колонки и линейной скоростью ПФ. Удваивая длину колонки, удваиваем время удерживания, удваивание линейной скорости, напротив, сокращает в 2 раза время удерживания. Через фактор удерживания k время удерживания t_R зависит от относительного количества НФ и ПФ.

Времена удерживания и все производные от них величины являются по существу термодинамическими характеристиками процесса. Однако, как в любом другом физико-химическом процессе, в хроматографии результат определяется совместным влиянием факторов термодинамического и кинетического типа. Если в хроматографической системе данного состава при данной температуре у вещества 1 и 2 значения t_R одинаковы, то никакое изменение геометрии колонки, расхода ПФ и других параметров не приведет к успешному разделению этой пары компонентов. Различие значений L в данном случае так же не гарантирует возможности добиться хорошего разделения. Колонка должна обладать высокими кинетическими характеристиками, акты сорбции-десорбции должны совершаться с достаточно быстрой скоростью, чтобы реализовать потенциальную возможность эффективного разделения.

В ходе хроматографирования в колонке и вне ее по мере прохождения по хроматографическому тракту (дозатор, предколонка, колонка, детектор, коллектор фракций, соединенные друг с другом капиллярами) происходит размывание узкой концентрационной зоны введенного вещества. По мере ее движения с подвижной фазой по тракту зона становится все шире, размываясь в результате диффузионных процессов. Эффект размывания характеризуется шириной пика у основания t_W, которую определяют как отрезок, отсекаемый на нулевой линии двумя касательными, проведенными к пику. Ширина пика увеличивается пропорционально квадратному корню из длины пути, пройденного веществом в колонке.

Мерой размывания полосы вещества в колонке является эффективность, определяемая числом теоретических тарелок N или высотой, эквивалентной теоретической тарелке, H.

Размывание хроматографических зон обусловлено в основном тремя следующими причинами.

1) Неоднородностью потока по сечению колонки, вследствие которой молекулы разделяемого вещества проходят пути различной длины. Влияние этого эффекта минимально, если колонка равномерно заполнена частицами малого диаметра с узким распределением частиц по размерам.

2) Продольной диффузией. Влияние этого вида диффузии в жидкостной хроматографии относительно мало, поскольку коэффициенты диффузии растворителей невелики, и этот эффект становится ощутимым лишь в том случае, если вещество находится в колонке длительное время.

3) Диффузией и сопротивлением массопереносу молекул, перемещающихся из одной фазы в другую, и отклонением от состояния равновесия вследствие диффузии. Величина данного эффекта в значительной степени зависит от объемной скорости. Снижение объемной скорости и использование сорбентов с малым размером частиц и открытой пористой структурой (это снижает длину диффузионного пути) уменьшают влияние эффекта. Повышение температуры колонки также уменьшает сопротивление массопередаче, так как увеличивает коэффициенты диффузии и уменьшает вязкость.

Общая величина H колонки выражается суммой вкладов всех этих факторов:

Н = Н_p + Н_d + Н_s + Н_m ,

где Н_p - вклад в размывание вихревой диффузии; Н_d - вклад в размывание молекулярной диффузии; Н_s - вклад, связанный с сопротивлением массопередаче в неподвижной фазе; Н_m - вклад, связанный с сопротивлением массопереносу в подвижной фазе. Чем меньше каждое из четырех слагаемых, тем меньше будет и суммарное значение H, а следовательно, эффективнее колонка.

Величина Н_p пропорциональна диаметру частиц сорбента и уменьшается с улучшением равномерности заполнения колонки сорбентом. Величина Н_d, заметно растет при низком расходе ПФ, что имеет значение в микроколоночной ВЭЖХ на насосах среднего давления. При типовых скоростях элюирования Н_d настолько мала, что ею можно пренебречь. Величина Н_m уменьшается при ускорении процессов адсорбции-десорбции, т. е. при использовании частиц малого размера и тонких пленок НФ, при уменьшении скорости потока. Кроме того, величина Н_m уменьшается при снижении размера частиц (пропорционально квадрату диаметра частиц), при более равномерном и плотном заполнении колонки сорбентом, уменьшении вязкости ПФ.

Таким образом, к числу основных параметров, контролирующих высоту, эквивалентную теоретической тарелке, относятся: объемная скорость, диаметр частиц сорбента (длина диффузионного пути), характер заполнения колонки, геометрия заполнения и коэффициент диффузии. Иначе говоря, размывание в колонке уменьшается и эффективность повышается, когда используют более мелкий сорбент, более равномерный по составу (узкая фракция), более плотно и равномерно упакованный в колонке, при использовании более тонких слоев привитой фазы, менее вязких растворителей и оптимальных скоростей потока.

Что касается размывания концентрационной зоны в таких частях хроматографического тракта, как инжектор, ячейка детектора, микрофильтры для улавливания механических частиц из пробы, устанавливаемые после инжектора, предколонки, капилляры, фитинги и др., оно тем больше, чем больше экстраколоночный объем по сравнению с удерживаемым объемом пика. В современных хроматографах источники дополнительного экстраколоночного размывания тщательно минимизируют.

Как сказано выше, эффективность колонки зависит от размера частиц сорбента. В большой степени бурное развитие ВЭЖХ в последние годы было обусловлено, во-первых, разработкой способов получения сорбентов с размером частиц от 1.5 до 10 мкм с узким фракционным составом, обеспечивающих высокую эффективность при хорошей проницаемости, во-вторых, разработкой способов заполнения этими сорбентами колонок и, в-третьих, разработкой и серийным выпуском жидкостных хроматографов, имеющих рассчитанные на высокие давления насосы, инжекторы и детекторы с кюветами малого объема, способные регистрировать пики малого объема.

Для хорошо упакованных суспензионным способом колонок приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке W ≈ 2 при размере частиц 3-10 мкм. В этом случае при стандартной длине колонок 250 мм их эффективность будет составлять от 40 до 12.5 тысяч теоретических тарелок. Наиболее эффективные колонки, заполненные частицами размером 1.5 мкм, требуют очень высокого рабочего давления насоса (до 320 МПа) и относительно низкой скорости потока элюента. При поиске компромиссного решения возникает вопрос о взаимосвязи размера частиц сорбента, эффективности и проницаемости колонок. Уравнение, которое связывает давление, размер частиц и другие важные хроматографические параметры, имеет следующий вид:

u = B_o p / ηL = рd²/ ψηL ,

где u - линейная скорость потока, определяемая из уравнения t_o = L/u; В_o - проницаемость колонки; р - давление; η - вязкость; L - длина колонки; ψ-фактор сопротивления колонки, d - диаметр частиц сорбента.

Согласно этой формуле, давление на входе в колонку пропорционально линейной скорости потока, фактору сопротивления колонки, вязкости растворителя и длине колонки, и обратно пропорционально квадрату диаметра частиц. Расчеты показывают, что существуют ограничения возможностей применения мелкодисперсных сорбентов (зернением < 5 мкм) в обращенно-фазовой ВЭЖХ, в связи с резким возрастанием противодавления. Для работы с такими сорбентами в режиме ОФХ требуются специальные насосы. Это требование менее критично для НФХ. Проницаемость колонки при прочих равных условиях лимитирует использование больших расходов растворителей, позволяющих сократить время анализа. Современной скоростной ВЭЖХ необходимы насосы, работающие со сверхвысокими давлениями.

При оценке качества колонки зачастую учитывается коэффициент асимметрии A_S. Предпочтение отдается колонкам, для которых значения A_S, лежат в интервале 0.8 - 1.2. Отклонение A_S от 1.0 обусловлено многими факторами, в том числе неравномерным распределением пробы по сечению колонки, наличием мертвых объемов, плохим качеством обработки стенки колонки и др.

Ряд фирм в качестве параметра качества колонки использует стабильность колонки, т. е. воспроизводимость N и A_S при проведении повторных анализов, которые, однако, существенно зависят от условий проведения эксперимента. Помимо ухудшения эффективности, проницаемости и симметрии пиков имеется еще и визуально контролируемый признак нестабильности - усадка слоя сорбента ниже верхнего обреза колонки. Основная причина проседания сорбента в колонке и потери эффективности - растворение самого силикагеля, даже привитого. Соответственно, предлагаются и разные способы предотвращения нестабильности и проседания, например особый метод заполнения ("вязкостная консолидация"), который позволяет получать высокоэффективные колонки, не проседающие длительное время и сохраняющие при этом нормальную проницаемость.

Для потребителей наиболее очевидными характеристиками приобретаемой или приготовляемой хроматографической колонки являются значения приведенного числа теоретических тарелок N’ и величина H'- отношение достигаемой высоты эквивалентной теоретической тарелки к среднему диаметру частицы сорбента. Что касается формы частиц, то и в случае частиц сорбента нерегулярной формы достижимы эффективности не меньшие, чем в случае частиц сферической формы. Это объясняется тем, что частицы нерегулярной формы могут быть упакованы более плотно, чем сферические. Однако при прочих равных условиях колонки, заполненные сферическими частицами, имеют лучшую проницаемость.