Лигандообменная хроматография

Лигандообменная хроматография также основана на динамическом модифицировании. В этом методе и неподвижная, и подвижная фаза могут содержать комплексообразующий ион металла, в результате чего разделение смеси веществ происходит за счет различия в константах комплексообразования веществ и разницы в коэффициентах распределения комплексов между подвижной и неподвижной фазами. Под лигандом понимают нейтральную молекулу или анион, связанный с ионом металла координационной связью. Путем обобществления неподеленной электронной пары донорного атома лиганда центральный катион металла достраивает свою электронную оболочку до структуры, аналогичной электронной оболочке атома инертного газа. Если связь лиганд-металл лабильна, один лиганд может замещать другой. Метод показал себя наиболее эффективным при разделении рацемических смесей аминокислот. Чаще всего в роли хирального разделяющего агента используют комплексы двухвалентной меди, двухвалентного цинка или никеля с L-пролином, L-гидроксипролином или L-фенилаланином. Применяют лиганды и с кадмием (II), и с ртутью (II), и с серебром (I). Ионы кадмия находят применение с серосодержащими лигандами, включая тиомочевину. Ионы серебра, введенные в состав ионообменной смолы, употребляют при хроматографировании гетероциклических оснований и ненасыщенных соединений. Ртуть (II) обладает большим сродством к серосодержащим лигандам.

Возможны ионообменный, ион-парный и обращенно-фазовый вариант лигандообменной хроматографии. Один из них предусматривает ковалентное связывание оптически активного агента, чаще всего аминокислоты, с матрицей сорбента. В хроматографическую систему подают подвижную фазу, содержащую ионы металла-комплексообразователя. Эти ионы связываются с оптически активным сорбентом. Модифицированный таким образом сорбент может образовывать диастереомерные хелатные комплексы. Например, если к сорбенту привита L-аминокислота, он может с рацемическим сорбатом образовывать L,L- и L,D-комплексы. Устойчивость этих комплексов различна, в результате этого параметры удерживания энантиомеров не одинаковы. В другом варианте лигандообменной хроматографии неполярный сорбент динамически модифицируется гидрофобным производным оптически активной аминокислоты, затем на нем фиксируется ион металла-комплексообразователя и при хроматографировании энантиомеров реализуется лигандообменный процесс. В третьем варианте используется стандартный обращенно-фазовый сорбент, модифицируется подвижная фаза. В этом случае диастереомерные комплексы образуются в элюенте, а сорбент энантиоселективными свойствами не обладает. Разделение достигается только за счет разной сорбируемости комплексов на гидрофобной поверхности неспецифической неподвижной фазы.

Сорбенты, используемые для удерживания катионов в лиган-дообменной хроматографии могут быть органическими, неорганическими или представлять собой комбинацию органических и неорганических структур, например, силикагели с привитыми функциональными группами. Наиболее распространенный органический катионообменник - сульфированный полистирол, сшитый дивинилбензолом. Степень сшивки 6-8%. Двухзарядные ионы, используемые в лигандообменной хроматографии вызывают электростатическое притяжение полимерных цепей, уменьшают набухаемость частиц, делая их более жесткими и устойчивыми к высокому давлению.

В качестве ПФ используют водные растворы аммиака в смеси с ацетонитрилом. Оптимальное соотношение воды и ацетонитрила находится в области эквиобъемных составов (примерно 1:1), концентрация аммиака 0.15-0.2 М. В ПФ могут добавлять соли соответствующего металла-комплексообразователя. Следует помнить, что силикагель растворяется в щелочных растворах, добавка органического растворителя уменьшает растворимость сорбента. Вместо аммиака в ряде случаев использовали пиридин. При разделении аминокислот на сульфированной полистирольной смоле, заряженной ионами цинка, в качестве подвижной фазы использовали буферные растворы ацетата натрия (рН=4.1), содержащие 3.5·10^-5 М цинка.

Другим распространённым применением лигандообменного механизма является разделение моно- и олигосахаридов, а также полиольных соединений. Разделение происходит за счёт образования лигандного комплекса с ионом металла, иммобилизированным на поверхности катионообменной смолы. В разделение вовлечены также такие механизмы, как сайз-эксклюзия, распределительный механизм, гидрофобная адсорбция, а также электростатическое притяжение и отталкивание. Сорбенты для лигандообменного разделения углеводов представляют из себя, как правило, сульфированный сополимер стирола и дивинилбензола со степенью сшивки 4-8%, на поверхности которого электростатически иммобилизирован катион одно-, двух- или трёхвалентного металла (Na⁺, Ag⁺, Са²⁺, Sr²⁺, Pb²⁺, Ва²⁺, Y³⁺, La³⁺, Pr³⁺). В качестве подвижной фазы обычно используют деионизованную воду. В качестве примера колонок для лигандообменного разделения углеводов можно привести колонки серии Rezex (Phenomenex, США).

Пример типовой хроматограммы лигандообменного разделения углеводов в пробе растворимого кофе.
Колонка: Rezex RPM-Monosaccharide 300х7.8 мм 8 мкм; режим разделения: изократический; подвижная фаза: вода; расход: 0.5 мл/мин; температура колонки: 85°С; объем пробы: 20 мкл; детектор: рефрактометрический.