Нормально-фазовая распределительная хроматография

Распределительная хроматография - это вариант ВЭЖХ, в котором разделение смеси на компоненты осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами: растворителем (ПФ) и фазой на сорбенте. Неподвижная фаза (НФ) более полярна, чем подвижная, в качестве последней используют те же смеси неполярных углеводородов и более полярных органических растворителей различной природы, что и в случае ЖАХ. Отличительной особенностью элюентов является только более высокая концентрация полярного модификатора. Так, для разделения этим методом малополярных веществ используют смеси типа гексан - изопропанол (95:5), гексан - хлороформ (1:1), среднеполярные вещества хроматографируют элюентами гексан - изопропанол (80:20), либо хлороформ - метанол (95:5). Для хроматографии полярных веществ часто подходящим оказывается состав хлороформ - метанол (80:20).

Получение неподвижных жидких фаз на пористых носителях возможно нанесением их на сорбент. Недостатком такого типа НФ является относительно быстрое вымывание фазы с носителя. За счет этого количество неподвижной жидкой фазы в колонке постепенно уменьшается, изменяя параметры удерживания сорбатов (время удерживания падает, пики становятся несимметричными). В данном случае для поддержания эффективности и селективности разделения ПФ необходимо насыщать нанесенной на носитель НФ. Унос также уменьшается при использовании вязких и малорастворимых в элюенте полимерных фаз. В настоящее время наиболее распространено использование химически привитых к сорбенту фаз. Привито-фазные сорбенты получают, например, замещением силанольных групп, находящихся на поверхности силикагеля, в результате их реакций со специальными реагентами.

Сложность технологии прививки реагентов, подготовки исходных материалов, многостадийность процесса приводят к тому, что даже полученные по одной технологии на одной фирме-изготовителе сорбенты могут иметь неидентичные хроматографические характеристики.

Основными привитыми фазами для нормально-фазной распределительной хроматографии являются пропилнитрильная и пропиламинная фазы, которые упрощенно называют нитрильной фазой или аминофазой. Каждая из них прививается с использованием соответствующего силана (диметиламинопропилхлорсилана или диметилцианпропилхлорсилана).

Химически привитые сорбенты в варианте НФХ работают, подобно силикагелю или оксиду алюминия, с теми же элюотропными рядами растворителей и ориентировочно близкими (но не тождественными) порядками элюирования соединений разных классов. За счет разной химической природы силанольных, амино- и нитрильных групп возникает различие в селективности разделения, позволяющее отдать предпочтение тому или иному сорбенту.

К преимуществам сорбентов с привитыми нитрильными или аминогруппами по сравнению с адсорбентами относят следующие моменты:

1) вследствие отсутствия силанольных групп вероятность необратимой адсорбции анализируемых веществ заметно уменьшается;

2) значительно уменьшается влияние воды на хроматографическое разделение, отпадает необходимость строго контролировать ее содержание в растворителях;

3) быстро достигается равновесие с новым составом растворителя, что позволяет оперативно переходить от методики к методике или успешно использовать градиентное элюирование;

4) возможно использование растворителей в широком диапазоне полярностей, колонки легко регенерируются;

5) сорбенты с привитыми аминогруппами проявляют свойства слабых анионообменников.

При применении сорбентов с аминофазами следует принимать во внимание их реакционную способность. Не рекомендуется использовать в качестве растворителей и компонентов проб вещества с оксогруппами (альдегиды и кетоны), так как в этом случае возможно разрушение структуры привитой фазы с образованием оснований Шиффа и необратимая сорбция некоторых компонентов проб. Аминофаза может быть легко окислена, поэтому следует исключить действие на сорбент сильных окислителей. Аналогично, при использовании нитрильной привитой фазы следует учитывать реакционную способность цианогруппы. Например, она способна подвергаться гидролизу в кислой или щелочной среде.

Находят употребление в хроматографической практике диэтиламиноэтильные, диметиламинопропильные и диольные полярные привитые фазы. Диольная НФ содержит в составе привитого фрагмента две гидроксильные группы. Она по своим сорбционным свойствам напоминает аминофазы, но ее селективность несколько отлична, что позволяет на этой разнице добиваться в ряде случаев улучшения разделения сорбатов.

Радикальных изменений в порядке элюирования органических веществ в режиме распределительной хроматографии при замене одной неподвижной фазы на другую не происходит. Причина в том, что молекулы сорбата вступают во взаимодействие с НФ не непосредственно, а только через молекулы сольватированного растворителя, которого тем больше, чем больше сольватирующие способности растворителя и больше сольватируемость полярных групп привитой фазы. Хотя природа привитых полярных групп (нитрил, амин, диол) заметно различается, нивелирующее действие сольватационных слоев полярных компонентов подвижной фазы на границе раздела фаз сглаживает эти различия. Поэтому улучшение разрешения заменой модификатора подвижной фазы, молекулы которого по иному сольватируют полярную группу сорбата и привитой фазы, добиться значительно легче, чем заменой сорта привито-фазного сорбента. Изменение объемной доли модификаторов, использование различных добавок в подвижную фазу при сохранении той же привитой полярной группы позволяет получить существенно более значимый результат.

Хроматограмма витаминов в пищевых продуктах, полученная на колонке с нуклеосилом NH (250x4 мм, зернение 10 мкм), ПФ гептан - хлороформ (80:20), расход 3,5 мл/мин, 254 нм, проба 5 мкл.