Обращенно-фазовая распределительная хроматография

Вариант распределительной хроматографии, в котором используют сорбенты с привитыми неполярными, как правило, длинными алкильными или алкилсилильными группами (а также фенильными, аминопропильными и др.) и полярный растворитель (например, водно-метанольные, водно-ацетонитрильные смеси) получил название обращенно-фазовой ВЭЖХ. Этот термин, указывает на перемену полярности неподвижной и подвижной фаз на противоположные в данном варианте ВЭЖХ.

В качестве разбавителя в ОФХ используют бидистиллированную и (или) деионизированную воду, а в качестве модификаторов преимущественно метанол и ацетонитрил, реже тетрагидрофуран. Спирты, кроме метанола, используют редко, так как их вязкость и вязкость водно-спиртовых элюентов слишком большие, что приводит к высокому рабочему давлению, ухудшает эффективность разделения вследствие затрудненной диффузии в подвижной фазе. Тетрагидрофуран нестабилен при хранении (легко окисляется, накапливая гидропероксиды, которые уменьшают диапазон пропускания УФ света, способны окислять привитую фазу, сорбаты и взрывоопасны). Ацетонитрил имеет ряд преимуществ перед метанолом. При хорошей очистке он лучше пропускает в ближнем ультрафиолетовом диапазоне (ниже 210 нм) и позволяет работать в смеси вода-ацетонитрил при 200 и даже 190 нм. Он обычно обладает лучшими растворяющими свойствами для органических проб, чем метанол, водно-ацетонитрильные смеси менее вязки, чем смеси вода - метанол. Наконец, не малую роль играет и то обстоятельство, что метанол относится к группе особо опасных ядов, находящихся на строгом контроле и учете, тогда как ацетонитрил к этой группе не относится.

Хроматограмма экстракта листьев стевии. Колонка - Luna NH2 250x4.6 мм. Подвижная фаза: деионизированная вода (рН 5,5) (А) - ацетонитрил (В). Программа градиента: 87-82,5% В за 12 мин, 82,5-79% В за 8 мин, 5% В - 5 мин, 5-87% В за 1 мин, 87%В - 3 мин. Объёмная скорость: 1.5 мл/мин. Детектирование: УФ 210 нм.

Существует принципиальное различие между процессами сорбции на полярных поверхностях из относительно неполярных растворителей (НФХ) и сорбции из воды либо сильнополярных растворителей на неполярных поверхностях (ОФХ). В первом случае между молекулами сорбатов и неподвижных фаз образуются ассоциаты за счет кулоновских взаимодействий или водородных связей. Во втором случае причиной ассоциации на поверхности являются так называемые сольвофобные взаимодействия в подвижной фазе. Для полярных ПФ, в особенности содержащих воду, характерно сильное кулоновское взаимодействие и образование водородных связей между молекулами растворителей. Все молекулы в таких растворителях связаны довольно прочно межмолекулярными силами. Для того чтобы поместить в эту среду молекулу сорбата, необходимо образование "полости" между молекулами растворителя. Энергетические затраты на образование такой "полости" лишь частично покрываются за счет взаимодействия полярных групп в молекуле сорбата с полярными молекулами растворителя. В аналогичном положении по отношению к растворителю находятся и неполярные молекулы неподвижной фазы. С энергетической точки зрения более выгодно такое положение, когда поверхность раздела между полярной средой (растворителем) и неполярными фрагментами неподвижной фазы и молекул сорбата минимальна. Уменьшение этой поверхности и достигается при сорбции.

Таким образом, причиной сорбции в ОФХ являются диполь-дипольные взаимодействия полярных молекул ПФ, их сильное притяжение одна к другой. Это приводит к сольвофобному вытеснению менее полярных молекул из полярной среды элюента к неполярной поверхности сорбента. Роль поверхности неподвижной фазы в ОФХ - выступать акцептором молекул сорбата, ориентированных к ней гидрофобным фрагментом и удерживать его слабыми дисперсионными силами. Наиболее существенными факторами удерживания сорбатов являются размеры их молекул, дипольный момент, поляризуемость и способность к гидрофобным взаимодействиям неполярной части молекулы, обеспечивающая уменьшение площади неполярной поверхности при сорбции.

Метод ОФХ в настоящее время является доминирующим в ВЭЖХ. Среди рутинных методик анализа 70-80% основаны на том или ином варианте ОФХ. Причины широкого внедрения метода в том, что для него налажено производство сорбентов, имеющих привитые алкилсилильные группы разной длины (от С₂, до С₁₈ с прямой алкильной цепью, фенильной и дифенильной группами), а растворители, используемые для этого метода (ацетонитрил, метанол, ТГФ, вода), позволяют работать с оптическими детекторами в УФ и видимом диапазоне спектра, так как они прозрачны в УФ свете.

Пределы прозрачности ПФ в зависимости от состава и химической чистоты модификатора лежат в области 190-220 нм. Наиболее доступный УФ детектор в условиях ОФХ приближается по возможностям к неселективному универсальному детектору, делая возможным анализ углеводов, липидов, сложных эфиров, спиртов и олефинов.

Хроматограмма антоцианидинов в условиях градиентной ОФХ: колонка Zorbax XDB-C18, 250x4.6 мм 5 мкм, 30°С, 520 нм, ПФ вода - метанол - ацетонитрил (90/6/4)→(0/85/15), расход 1 мл/мин. В воду добавляли 0.05% трифторуксусной кислоты.

Растворители, используемые в ОФХ, относительно легко растворяют многие практически важные органические и природные вещества, находящиеся в организме человека, биологических объектах, в пище, лекарственных препаратах, и т.д.

Сорбенты в обращенно-фазовой ВЭЖХ быстро приходят в равновесие с новыми растворителями и при изменении состава растворителя, что позволяет без проблем переходить от одной методики к другой с использованием одной и той же колонки, а также широко применять градиентное элюирование с быстрым восстановлением равновесия сорбента с исходным растворителем. Сорбенты дают возможность использовать растворители в широком диапазоне свойств, а также добавки разных типов (соли, кислоты и основания, ион-парные реагенты, органические модификаторы).

Следует иметь в виду, что характеристики удерживания и селективности для обращенно-фазовых сорбентов меняются не только при переходе от сорбента одного производителя к сорбенту другого (например, от силасорба С18 к партисилу ОДС), формально имеющих одинаковую привитую фазу. Эти характеристики меняются более или менее значительно даже при переходе от одной партии сорбента к другой партии того же производителя. Исходные силикагели, используемые разными фирмами, заметно различаются по поверхности, объему и размеру пор. Для прививки фаз с общим названием С18 или ОДС применяют разные и по структуре, и по химической однородности реагенты. Например, для получения привитой фазы ОДС (октадецилсилан, ODS) используют октаде-цилтрихлорсилан, метилоктадецилдихлорсилан и диметилоктадецилхлорсилан. Если используют ди- или трифункциональные силаны, то в зависимости от степени безводности растворителей и силикагеля, на поверхности может получиться мономерная пленка фазы (монослой) или же полимерная (чем больше воды, тем выше степень полимеризации). Свойства мономерной и полимерных пленок с разной степенью полимеризации изрядно различаются. Наконец, силанольные группы, находящиеся на поверхности исходного силикагеля, к которому прививается фаза, не могут из-за пространственных затруднений быть полностью замещены. Например, диметилоктадецилсилильными группами в самых жестких условиях прививки удается заместить примерно половину силанольных групп. Остающиеся силанольные группы не удается полностью устранить даже в процессе так называемого "эндкеппинга" (окончательного покрытия поверхности силикагеля), когда используют молекулы более активного низкомолекулярного силана (обычно триметилхлорсилана). Силанольные группы на поверхности такого привитого сорбента могут взаимодействовать с некоторыми компонентами пробы и в ряде случаев являются фактором удерживания, конкурирующим с сольвофобными процессами.

Наряду с неполярными привитыми фазами, выпускаемыми специально для ОФХ, в обращенно-фазовом варианте часто используют нитрильную и аминную привитые фазы, а иногда и диольную. В этом случае они разделяют вещества в основном по сольвофобному механизму, как имеющие короткий (C₃) привитой алкилcилан, а полярные группы или не участвуют в разделении, или играют второстепенную роль, несколько меняя селективность для ряда веществ определенной химической структуры.

Одна из важных причин, способствовавших быстрому росту применения обращенно-фазовых сорбентов в ВЭЖХ, это их способность четко разделять серии гомологов в порядке возрастания их молекулярной массы. При этом гомологи могут, в отличие от разделяемых методами ЖАХ или НФХ, не иметь функциональных групп, т.е., обращенно-фазовый сорбент может разделять гомологи алканов, аренов, фенолов и т.д. Это вовлекает в область анализа методом ВЭЖХ такие важные объекты, как компоненты нефти и продукты нефтехимии. Если нужно разделить вещества неполярные или малополярные, практически любой обращенно-фазовый сорбент может при относительно простом подборе растворителя обеспечить почти идентичное разделение.