Методика выполнения измерений массовой доли бенз(а)пирена в пищевых продуктах, продовольственном сырье, пищевых добавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

1. Объекты исследования

Настоящая методика выполнения измерений распространяется на копченые мясные, копченые рыбные и жировые продукты и устанавливает определение массовой концентрации бенз(а)пирена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием.

2. Диапазон измерений

ПДК бенз(а)пирена в жировых, копченых мясных, копченых рыбных продуктах составляет 1 мкг/кг.

Метод обеспечивает получение результатов измерений массовой концентрации бенз(а)пирена в диапазонах, представленных в таблице 1.

Таблица 1. Диапазоны измерения массовой концентрации бенз(а)пирена

3. Пробоподготовка

Отбор, консервация и хранение проб продукции проводится в соответствии с ГОСТ 7631, ГОСТ 9792, ТУ и другой нормативной документацией, регламентирующей отбор проб для конкретных видов продукции.

Пробоподготовка состоит из этапов отбора пробы (пробу предварительно охлаждают при температуре минус 12-18 °С в течение 30 мин), измельчения, гомогенизации с натрием сернокислым безводным, экстракции гомогенизированной пробы гексаном в колбе с использованием УЗ-ванны, самопроизвольного осаждения твердого осадка (в течении 1-2 мин), обезжиривания экстракта в морозильной камере (в цилиндр вносят навеску силикагеля, приливают экстракт, содержимое цилиндра помещают в морозильную камеру), очистки надосадочного гексанового слоя методом неудерживающей твердофазной экстракции (на картриджах Strata Silica Si–1)*, отдувки элюата в токе воздуха или инертного газа.

* Примечание. При концентрации жиров исходного анализируемого продукта менее 5%, к исходному экстракту пробы после вымораживания необходимо добавить небольшое количество элюирующего реагента – этилацетата (0,1 мл к 6 мл очищенного экстракта).

Блок-схема процедуры пробоподготовки

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов бенз(а)пирена, подготовленной пробы продукта.

Для хроматографического анализа бенз(а)пирена необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с флуориметрическим детектированием.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы из ГСО раствора бенз(а)пирена в гексане или из ГСО раствора бенз(а)пирена в ацетонитриле (растворитель отдувают, перерастворяют стандартный образец в гексане); проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

• хроматограф жидкостный «Стайер М» с флуориметрическим детектором;
• персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

• изократический режим;
• колонка: Luna С18(2) 150х3,0 мм 3 мкм (Phenomenex, США);
• защитная колонка: С18 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
• подвижная фаза: раствор ацетонитрил/вода (75:25);
• скорость потока: 0,3 мл/мин;
• объем петли: 10 мкл;
• температура: 50°С;
• диапазон RFU: 0,01;
• детектирование: флуориметрическое (λex: 365±2 нм; λem: 400-460 нм).

Градуировку проводят по градуировочным растворам (во всем диапазоне определяемых концентраций) не реже 1 раза в две недели, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение количественного содержания бенз(а)пирена в пробе продукта.

Для определения количественного содержания компонента пробы продукта (бенз(а)пирена) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.

При использовании программного обеспечения «МультиХром» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации в пробе, введенной в хроматограф (но не в исходном образце, взятом для исследования!).

Для получения результата необходимо провести как минимум два параллельных измерения (получить две хроматограммы). За результат измерений принимают среднее арифметическое значение содержания бенз(а)пирена в концентрате анализируемой пробы C_хр, мкг/л (рассчитывается из двух значений массовой концентрации бенз(а)пирена в концентрате анализируемой пробы С₁ и С₂).
Массовую долю бенз(а)пирена в анализируемой пробе (в исходном образце) Х, мкг/кг рассчитывают по формуле:

где:
С_хр – среднее значение концентрации бенз(а)пирена, полученное в результате хроматографирования в двух параллельных измерениях [нг/мл];
V₁ – объем исходного экстракта, фактически равный объему гексана, взятого для первичной экстракции (50 мл);
V₂ – объем экстракта (часть исходного), взятого на вымораживание (30 мл);
V₃ – объем экстракта (часть экстракта после вымораживания), взятого для проведения ТФЭ (6 мл) [мл];
V₅ – объем конечного экстракта, часть из которого вводится в хроматограф (около 3 мл) [мл];
K_{пробоотбора} – коэффициент пробоотбора, учитывающий долю массы пробы продукта (в смеси с сульфатом натрия) взятого для экстракции, от общей массы пробы, взятой на анализ. Во всех случаях равен 0,736;
K_{вымораживания} – коэффициент потерь бенз(а)пирена при вымораживании. Для всех категорий исследуемых продуктов этот коэффициент одинаков и равен 0.95;
K_экстр.1 – коэффициент первичной жидкостной экстракции гексаном. Для всех категорий исследуемых продуктов одинаков и равен 0.95;
K_{ТФЭэкстр.2} – коэффициент твердофазной экстракции бенз(а)пирена, равен 0,95;
m_пр. – почвы или грунта, взятой на анализ [г].