Фотометрические детекторы
Наиболее часто в ЖХ применяют фотометрические детекторы, работа которых основана на измерении поглощения (абсорбции) света в ультрафиолетовой или видимой областях спектра. Это связано с тем, что большинство химических соединений имеют достаточно интенсивные полосы поглощения в диапазоне длин волн 200-800 нм. Наличие подходящих растворителей, прозрачных в этом диапазоне длин волн, делает фотометрические методы особенно пригодными для градиентного элюирования. Фотометрические детекторы имеют достаточно высокую чувствительность для поглощающих свет веществ, широкий линейный динамический диапазон (до 105), малый рабочий объем ячеек (<1мкл), небольшое экстраколоночное расширение пиков и высокую воспроизводимость показаний. Они являются недеструктивными, относительно нечувствительными к колебаниям потока подвижной фазы и изменениям температуры. Чувствительность фотометрических ультрафиолетовых детекторов может доходить до 0,001 единиц оптической плотности на всю шкалу при 1% шума. При такой высокой чувствительности могут быть зафиксированы малые количества (до нескольких нг) слабо абсорбирующих УФ веществ. Широкая линейная область позволяет анализировать как примеси, так и основные компоненты на одной хроматограмме.
Фотометрические детекторы подразделяют на детекторы с фиксированной длиной волны, детекторы со сменной с помощью фильтров длиной волны и спектрофотометрические детекторы с плавно изменяемой длиной волны в определенной области длин волн.
Наиболее простые и дешевые УФ детекторы широко применяют в ВЭЖХ на приборах, предназначенных для массовых анализов. При применении ртутной лампы низкого давления, обладающей высокой стабильностью и долгим временем жизни (более 5000 ч), детектирование проводят на длине волны 254 нм, которой соответствует 90% энергии излучения. На этой длине волны высоким поглощением обладают многие органические соединения (ароматические, гетероциклические, кетоны и др.). В таком детекторе свет от источника излучения проходит через проточную ячейку, в которую из хроматографической колонки поступает поток элюента. Наиболее часто применяют ячейки с длиной оптического пути 10 мм, диаметром светового канала около 1 мм, с рабочим объемом около 8 мкл. Они оптимальны для аналитических колонок внутренним диаметром 4-6 мм, заполненных сорбентом с размером частиц около 5 мкм. Рабочий объем ячейки является одним из важнейших ее параметров. Например, ячейка объемом 8-10 мкл может привести к дополнительному размыванию пика на 30-50 мкл и может оказаться непригодной для пиков шириной менее 100 мкл. Уменьшение объема ячейки может быть достигнуто двумя путями: уменьшением длины оптического пути и уменьшением диаметра канала ячейки. Последнее приводит к падению интенсивности проходящего через нее света и к увеличению шума. Оба эти эффекта снижают чувствительность детектирования.
C целью компенсации фона в детекторах чаще всего используют две ячейки: рабочую и сравнительную. Для двухканального детектирования используют статический метод подключения сравнительной ячейки, в котором ее заполняют чистым растворителем; и динамический метод, когда поток элюента от насоса разделяют на 2 части и пропускают одну часть через рабочую, а другую часть через сравнительную колонку и сравнительную ячейку. В третьем варианте используют динамический метод с использованием дополнительного насоса низкого давления для пропускания через сравнительную ячейку того же растворителя. В динамическом режиме можно подсоединять сравнительную ячейку между сосудом с растворителем и насосом в зоне всасывания, а рабочую ячейку - после разделительной колонки. В последнее время получили распространение детекторы с одной ячейкой с компенсацией шума при помощи электронных средств.
Одной из основных проблем конструирования фотометрических детекторов является обеспечение возможности фотометрирования в достаточно широком диапазоне длин волн. Это необходимо не только для получения максимальной чувствительности на длине волны, соответствующей ширине полосы максимального поглощения вещества, но и для значительного снижения чувствительности, облегчающего линейное детектирование при высоких концентрациях в случае препаративной хроматографии. Спектральный диапазон и степень его разделения на поддиапазоны зависит от спектральной характеристики источника изучения и от способа выделения необходимой спектральной полосы, осуществляемого до измерительной ячейки или после нее. Некоторые источники излучения имеют линейчатый спектр (например, ртутная лампа - 254, 303, 313, 365, 436, 546 нм и т.д.), другие -непрерывный спектр (например, дейтериевая лампа излучает в диапазоне 190-600 нм). Интенсивность их излучения в пределах рабочего диапазона приблизительно одинакова. Необходимую спектральную полосу выделяют двумя различными способами: с помощью дифракционных решеток, имеющих 1000-3000 штрихов на 1 мм, и применением интерференционных фильтров с заданной шириной спектральной полосы. В обоих случаях может быть получена спектральная полуширина от 1-2 нм до 10-20 нм.
Характерной особенностью многих фильтровых УФ детекторов является использование в них источников линейчатого спектра. Кроме ртутной применяют кадмиевую и цинковую лампы с линиями на 229 и 214 нм соответственно. Применяют также преобразователи излучения с 254 на 280-290 нм и другие длины волн, отсутствующие в спектре ртути. Фильтровый УФ детектор, например, с четырьмя интерференционными фильтрами на 217 нм (полуширина полосы пропускания 20 нм), 254 нм (42 нм), 263 нм (15 нм), 279 нм (12 нм) перекрывает область 200-300 нм и реализует полные возможности 4-хволновой записи хроматограмм, в том числе получение разностных хроматограмм и спектральных отношений. В этих случаях хроматографически неразделенные пики можно выделить количественно вычитанием стандартного сигнала из сигнала пробы.
В связи с вышеизложенным, применение УФ детекторов с дейтериевой лампой в качестве источника света и набором широкополосных фильтров позволяет выпускать недорогие 2-х - 4-хволновые детекторы с выбором длин волн в диапазоне 200-300 нм.
Дополнительные возможности в детектировании дают спектрофотометрические детекторы, позволяющие работать в многоволновом режиме. Такие детекторы предназначены для фотометрирования элюата, выходящего из хроматографической колонки при различных длинах волн, например, в спектральном диапазоне 190-360 нм. Спектрофотометрический детектор состоит из источника света, монохроматора и фотометра. В качестве источника света применима дейтериевая лампа. Изменение длины волны осуществляется поворотом дифракционной решетки монохроматора с помощью шагового двигателя. Монохроматический световой пучок, управляемый вибратором, поочередно проходит через рабочую и сравнительную проточные ячейки. На мониторе ВЭЖХ прибора фиксируется хроматограмма при нескольких аналитических длинах волн, в остановленном потоке имеется возможность зарегистрировать спектр поглощения индивидуального сорбата.
1. Никотиновая кислота (витамин РР)
2. Тиамин (витамин B1)
3. Аскорбиновая кислота (витамин C)
4. Пиродоксин (витамин В6)
5. Цианокобаламин (витамин В12)
6. Рибофлавин (витамин В2)
Хроматограмма стандартной смеси водорастворимых витаминов.
Колонка: Synergi Hydro-RP 150х4.6 мм 4 мкм; защитная колонка: SecurityGuard C18 Aq 4x3.0 мм; подвижная фаза: А - 1% H3PO4 в воде, B - ацетонитрил; градиент: A/B (97:3) – 1 мин, A/B (55:45) – за 8 мин, A/B (10:90) – за 1 мин, A/B (10:90) – 4 мин, A/B (97:3) – за 0.5 мин, A/B (97:3) – 6.5 мин; расход: 0.9 мл/мин; объем пробы: 20 мкл; детектирование: спектрофотометрическое, длина волны 254 нм.
Одним из перспективных направлений развития фотометрических детекторов является применение фотодиодной матрицы. В таких детекторах непрерывное излучение источника проходит через проточную рабочую ячейку и попадает на дифракционную решетку. Луч отклоняется и фокусируется на плоскости, где расположена фотодиодная матрица, состоящая из 200-250 элементарных фотодиодов. Детектор выдает информацию сразу обо всем диапазоне длин волн 190-600 нм с дискретностью 2-5 нм в течение 10 мс. В связи с тем, что при регистрации спектра создается большой массив информации, обработка и запись спектров проводится с помощью быстродействующих компьютера и регистратора. Фотодиодные матричные детекторы позволяют получить за время одного анализа до 200-250 хроматограмм при разных длинах волн или трехмерную спектрохроматограмму, в которой по одной оси откладывается время удерживания, по другим - оптическая плотность и длина волны. Замечательная особенность детекторов на фотодиодной матрице заключается в том, что они позволяют проводить количественные оценки даже в случае, когда хроматографические пики не разделяются и перекрываются на всех длинах волн.
К фотометрическим детекторам относится также детектор, работа которого основана на поглощении света в инфракрасной области спектра. Некоторые функциональные группы органических соединений имеют характеристические частоты в ИК области, поэтому инфракрасные детекторы пригодны для идентификации органических соединений. Одним из основных условий работы этих детекторов является прозрачность применяемых растворителей в ИК области спектра. Наиболее подходящими, но относительно редко применяемыми в хроматографической практике, растворителями являются СCl4, СНСl3 и CS2. Адсорбция ИК излучения может быть использована как для селективного, так и неселективного детектирования. Если ранее детекторы этого типа применяли главным образом в эксклюзионной хроматографии с колонками большого диаметра, то в настоящее время они все шире внедряются в ВЭЖХ. Свет от источника в детекторе проходит через обтюратор и диск с укрепленными на нем тремя интерференционными фильтрами на диапазоны 2.5-4.5, 4.5-8.0 и 8.0-14.5 мкм. Диск вращается, и любой из фильтров может быть легко установлен на пути луча света. Монохроматический ИК свет после фильтра проходит через щель и затем через ячейку детектора, которая обычно имеет длину оптического пути близкую к 1.0 мм. Прошедший ячейку свет попадает на термоэлектрический детектор, сигнал которого усиливается усилителем и передается на регистрирующее устройство.
Для всех соединений, имеющих одинаковые функциональные группы, показания ИК детектора примерно одинаковы. В связи с независимостью показаний от молекулярной массы анализируемых соединений, этот детектор имеет значительные преимущества по сравнению, например, с рефрактометрическим детектором. Его молярные показания практически постоянны. Детектор достаточно стабильно работает при повышенных температурах ячейки (до 150 °С). В оптимальных условиях он может чувствовать около 1 мкг вещества с М=300, содержащего группу ОН и на длине волны 3.4 мкм. Более сильно абсорбирующие ИК излучение функциональные группы обеспечивают более высокую чувствительность, которая, однако, в среднем не превышает чувствительность рефрактометрического детектора.
Имеются ЖХ системы, объединяющие жидкостный хроматограф с ИК-спектрометром, использующим преобразования Фурье. Такая система позволяет одновременно записывать несколько хроматограмм на ряде выбранных оператором полосах ИК спектра. Она позволяет анализировать органические вещества на уровне 1 мкг и служит для идентификации компонентов пробы, причем не полностью разделенные хроматографические пики могут быть разрешены с помощью программного обеспечения.
Для фотометрических детекторов в настоящее время подбираются новые источников излучения, совершенствуются конструкции проточных ячеек, регистрация и обработки сигналов выполняется на компьютерах при помощи все более мощных программных продуктов.
