Флуориметрические детекторы

Принцип действия флуориметрического детектора основан на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света. Поглощение обычно проводят в УФ-области спектра при длине волны максимального поглощения для данной группы веществ, а излучение измеряют на выходе фильтра, не пропускающего лучи возбуждения. Длины волн флуоресцентного излучения всегда превышают длины волн поглощенного света. В связи с тем, что детектирование ведется от нулевой интенсивности флуоресценции, данный тип детектора более чувствителен по сравнению с детекторами поглощения. В тех случаях, когда сорбат не флуоресцирует, можно до или после разделения компонентов на колонке получить соответствующие производные.

В флуориметрическом детекторе свет от источника излучения УФ света проходит через фильтр и фокусируется в проточной ячейке с прямоугольной или линейной конструкцией ввода возбуждающего света и вывода света эмиссии. Излучение проходит через фильтр и измеряется с помощью фотоприемника.

 

При этом подвижная фаза (растворитель) не должна поглощать свет ни на длине волны поглощения, ни на длине волны излучения. Для сильно флуоресцирующих веществ предел детектирования достигает 10^-12 г. При соответствующем выборе системы растворителей детектор пригоден для использования в градиентной хроматографии. С помощью флуориметрического детектора с высокой чувствительностью можно детектировать аминокислоты, амины, витамины и стероиды. Высокая чувствительность является одним из главных его преимуществ. Этот детектор можно также применять для количественного определения микропримесей веществ и качественного определения ароматических углеводородов, биологически активных соединений, метаболитов и других флуоресцирующих соединений.

 

Хроматограмма пробы питьевой воды, загрязнённой бенз(а)пиреном в концентрации 0,0005 мкг/л.
Колонка: Luna С18(2) 150х3.0 мм 3мкм, элюент: ацетонитрил-вода (74:26), расход: 0.3 мл/мин, детектирование: флуориметрическое (поглощение 305-395 нм, испускание 430-470 нм)

Значительное увеличение чувствительности флуориметрического детектора возможно при применении вместо ртутной лампы монохроматического лазера и гибких оптических световодов для введения света непосредственно в проточную ячейку малых размеров. При введении конца световода непосредственно в кварцевую капиллярную ячейку на выходе из хроматографической колонки и облучении ее несколько выше по ходу потока помощью Ar-ионного лазера под углом 90° получена чувствительность на уровне десятков пг для некоторых лекарственных препаратов. Предложен также лазерный флуориметрический детектор с двухфотонной наведенной флуоресценцией. Описан флуоресцентный метод детектирования, основанный на возбуждении молекул пробы (β-частицами от ⁶³Ni-радиоактивного источника.

Применение флуориметрического детектора в ВЭЖХ дает возможность повысить селективность детектирования многих соединений. Получение флуоресцирующих производных с помощью химических реакций значительно расширяет эту возможность. Флуоресцентное детектирование с одновременным изменением рН подвижной фазы после колонки дает возможность увеличить флуоресценцию некоторых соединений и делает детектирование более специфичным. Селективность детектирования может быть также увеличена путем более тщательного выбора длины волны детектирования. Одновременное сканирование длины волн возбуждения и эмиссии позволяет установить чистоту вещества, регистрируемого одним пиком, провести его идентификацию. Следует отметить, что примеси, содержащиеся в подвижной фазе, и в первую очередь, растворенный кислород, способны вызывать гашение флуоресценции. Такое же действие оказывают кислородсодержащие растворители.